乙醇酸氧化酶（glycollic oxidase, GO）試劑盒使用說明書

乙醇酸氧化酶（glycollic oxidase, GO）試劑盒說明書
分光光度法50管/48樣
 
注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
乙醇酸氧化酶（EC1.1.3.15）是植物光呼吸代謝中的關(guān)鍵酶，也是光下合成草酸的關(guān)鍵酶，它催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，對(duì)研究光呼吸代謝過程及其調(diào)控具有重要意義。

測(cè)定原理：
乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，乙醛酸和鹽酸苯肼反應(yīng)生成乙醛酸苯腙，在324nm有特征吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、1mL石英比色皿。

試劑組成和配制：
提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體35mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1瓶，4℃避光保存，臨用前加10mL雙蒸水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑三：液體5mL×1瓶，4℃保存。

酶液提�。�
按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。12000g， 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
測(cè)定操作表：
 

	測(cè)定管
樣本（μL）	50
試劑一（μL）	650
試劑二（μL）	200
試劑三（μL）	100
充分混勻，立即于1mL石英比色皿中測(cè)定324nm處10s和190s吸光值A(chǔ)1和A2，△A=A2- A1

酶活性計(jì)算公式：
1．按照蛋白濃度計(jì)算
酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1 nmol乙醇酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
GO活性（nmol/min /mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 392×△A÷Cpr
 
2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活性定義：每克組織每分鐘氧化1 nmol乙醇酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
GO活性（nmol/min /g 鮮重）= ×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 392×△A÷W
ε：乙醛酸苯腙毫摩爾消光系數(shù)：17L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)總體積，1mL；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，3min
 
注意事項(xiàng)：

• 測(cè)定之前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，若吸光值較高，請(qǐng)將樣品用提取液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂屧贉y(cè)定，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
• 色素含量較高的樣品，可在提取酶時(shí)加活性炭吸附。