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NTA +LC-MS/MS組合在外泌體蛋白質(zhì)組研究的應(yīng)用

瀏覽次數(shù):735 發(fā)布日期:2023-3-7  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負

外泌體和其他小細胞外囊泡 (sEV) 是細胞間通訊和代謝調(diào)節(jié)的重要介質(zhì),包含蛋白質(zhì)、編碼和非編碼 RNA、DNA和代謝物,存在于生物體的體液中,包括血漿/血清、尿液和腦脊液。sEV內(nèi)容物受生理和病理狀態(tài)影響,因此它們可用作診斷和預(yù)測多種疾病預(yù)后的標志物。過去的研究主要針對sEV中miRNA,而對蛋白質(zhì)組的研究較少。本文作者利用質(zhì)譜技術(shù)研究不同細胞系分泌sEV中的蛋白質(zhì)組特征,發(fā)現(xiàn)不同細胞類型的sEV中蛋白質(zhì)的獨特性質(zhì),以及這些蛋白質(zhì)的表達水平如何用作識別組織來源的生物標志物。

 

01

文章詳情

文章題目:Tissue differences in the exosomal/small extracellular vesicle proteome and their potential as indicators of altered tissue metabolism

中文題目:外泌體/小細胞外囊泡蛋白質(zhì)組的差異及其作為組織代謝變化指標的潛力

發(fā)表時間:2022.01

期刊名稱:Cell Reports

影響因子:9.995

實驗方法:NTA納米粒子追蹤分析+LC-MS/MS

DOI:10.1016/j.celrep.2021.110277

 

02

圖解摘要

通過比較蛋白質(zhì)組學(xué),作者確定了來自多種細胞類型的外泌體/sEV共有的標志物,以及每種細胞類型獨有的標志物。使用脂肪營養(yǎng)不良小鼠模型,揭示了sEV蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集來預(yù)測體內(nèi)循環(huán)外泌體/sEVs的起源組織的用途。

 

03

研究內(nèi)容

1、細胞產(chǎn)生的sEVs具有不同的蛋白質(zhì)組特征

研究者從5個代謝調(diào)節(jié)小鼠模型細胞系提取外泌體和sEVs,大小在50到200納米之間,并通過NTA分析確定大小分布在5個細胞系中沒有區(qū)別,但各細胞系釋放顆粒的速度有很大區(qū)別,分化的3T3-L1釋放sEVs最快,而分化的C2C12釋放的最慢。為了探究這些不同細胞釋放的sEVs中蛋白質(zhì)組的差異,研究者利用LC-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)分析蛋白質(zhì)組成,共鑒定到431種蛋白質(zhì)。GO富集分析結(jié)果表明這些蛋白質(zhì)多為胞外蛋白(細胞表面或分泌蛋白),或位于細胞質(zhì)和質(zhì)膜上,功能上主要參與蛋白質(zhì)代謝、大分子處理、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和應(yīng)激反應(yīng)。利用PCA分析將5個細胞系分為2個clusters,一個包含C2C12(肌管)和AML12(肝細胞),一個包含3T3-L1(脂肪細胞)、BrAd和SVEC(內(nèi)皮細胞)。通路富集分析表明,內(nèi)皮細胞與白色和棕色脂肪細胞釋放的sEV富集了參與分解代謝過程和有機酸、羧酸、氮化合物代謝的蛋白質(zhì),且差速離心法分離出的sEVs中檢測到了10種糖酵解途徑中的酶。內(nèi)皮細胞與棕色和白色脂肪細胞的sEVs富集了脂肪酸合成和脂蛋白代謝的重要酶蛋白。肝細胞和肌管釋放的sEVs參與細胞遷移/黏附、免疫反應(yīng)、細胞結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)和脂質(zhì)與甘油磷脂代謝。這些結(jié)果表明,盡管這些細胞系存在顯著的代謝差異,但它們的sEVs中蛋白質(zhì)組存在意想不到的相似性,將這些細胞系分成2種模式。

Fig.1 實驗設(shè)計和各細胞類型釋放的sEV的表征
Fig.2 在分離的sEV中觀察到的蛋白質(zhì)組表達模式

 

2、不同細胞系sEV蛋白marker鑒定

Tetraspanins家族蛋白CD63、CD9和CD81,在過去研究表明,在sEV中表達豐富,因此常常被用作sEV鑒定、定量或純化的marker。然而,在研究者的結(jié)果中,這三個蛋白質(zhì)在不同細胞系中的表達水平有很大差異。脂肪和肌管細胞系中的sEVs表達水平高,但在內(nèi)皮細胞和白色與灰色脂肪細胞中表達水平低。相反,研究者從自己的質(zhì)譜結(jié)果中鑒定到6個在sEV中表達水平相似的蛋白質(zhì),可能是更好的sEV蛋白marker,分別是ENO1、GPI、HSPA5、YWHAB、CNTN1和CSF1R。前四個蛋白質(zhì)被預(yù)測定位于sEV管腔,后兩個被歸為膜蛋白,因此也可以作為表面marker。

用WB對5種細胞系特異性表達的蛋白質(zhì)進行分析,鑒定了每個細胞類型的特異性marker,即3T3L1:ADIPOQ、CD36;AML12:EGFR、ITGB1;C2C12:SPARC、IGFBP5;SVEC:HSP90;BrAd:POSTN、THBS1。此外,進入sEVs的蛋白質(zhì)可能與這些蛋白質(zhì)在細胞類型的豐度和外泌體分泌通路有關(guān)。WB結(jié)果表明,一些蛋白質(zhì)在sEV和細胞的表達水平成比例,如ADIPOQ、SPARC、FASN、IGFBP5。而其他一些蛋白在某些細胞類型的sEVs中與其他細胞類型相比顯著上調(diào),而在細胞表達水平相似,表明存在細胞類型特異性機制使得這種蛋白被分選進入sEV中。從培養(yǎng)細胞和原代細胞提取sEV并用質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)組,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)細胞(3T3-L1)sEV特異表達的蛋白也富集在原代細胞sEV中,表明兩種來源的sEV蛋白質(zhì)組非常相似。

Fig.3 Tetraspanins在不同細胞類型的sEV中表達并不相同
Fig.4每種細胞類型SEV標志物的免疫印跡

 

3、血清sEV蛋白作為代謝性疾病組織變化的指標

為了確定sEV蛋白質(zhì)組是否發(fā)生改變并可能有助于代謝表型,研究者從12周大的對照和 AdicerKO小鼠中分離出血清sEV,并對它們進行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析。其中86個蛋白質(zhì)在對照和KO小鼠之間表達不同,AdcerKO的sEV中40個上調(diào)和46個下調(diào)。富集分析表明上調(diào)通路top10中包含視黃醇代謝和補體激活途徑,下調(diào)通路top10中包含炎癥反應(yīng)和鐵代謝。有趣的是,表達水平高度變化的蛋白質(zhì)包括通常由肝臟、脂肪和其他組織分泌的蛋白質(zhì)。為了追蹤AdicerKO sEV中顯著改變的蛋白質(zhì)的來源,研究者將這些蛋白質(zhì)中的每一種與前文確定的細胞類型特異sEV蛋白質(zhì)的體外數(shù)據(jù)交互分析,發(fā)現(xiàn)其中三種在KO模型中上調(diào)的蛋白來自肝細胞,只有一種蛋白質(zhì)來自SVEC且在KO模型中上調(diào)表達,25種蛋白質(zhì)來自肌肉細胞,其中12種上調(diào),13種下調(diào)。重要的是,有5種蛋白可能是脂肪細胞特異的,且這些蛋白在sEV的表達變化與對應(yīng)組織中該蛋白的表達水平變化一致。這些數(shù)據(jù)表明,血清sEV中蛋白質(zhì)豐度的變化可以反映組織質(zhì)量和組織中蛋白質(zhì)表達的變化,這些組織選擇性地將這些蛋白質(zhì)輸出到它們的sEV中。

 

Fig.5 AdicerKO小鼠血清sEV蛋白質(zhì)組的變化

 

4、脂聯(lián)素作為白色脂肪細胞sEV的標志物

脂肪因子ADIPOQ是一種重要的胰島素增敏劑,由脂肪細胞獨特分泌,是白色脂肪sEV獨特的標志物。HMW脂聯(lián)素是其主要的生物活性形式,在與其受體AdipoR1/2結(jié)合時,以組織依賴性方式激活A(yù)MPK或PPARγ通路。此外,HMW脂聯(lián)素與內(nèi)皮細胞中的 T-鈣粘蛋白結(jié)合,調(diào)節(jié)血管形成,并已被證明可刺激sEV釋放。免疫金標法證實sEV中存在ADIPOQ,sEV分離前后血清進行WB和ELISA分析發(fā)現(xiàn)血清中的大部分ADIPOQ是游離的,sEV組分中僅存在一小部分,其主要存在形式為MMW和HMW。在AdcerKO小鼠中,血清和sEV中兩種形式的豐度均有所下降?紤]到對照和AdicerKO小鼠的sWAT中的ADIPOQ蛋白表達相似,這可能是由于在KO組中觀察到的脂肪營養(yǎng)不良而發(fā)生的。為了確定sEV中的ADIPOQ是在囊泡表面還是在囊泡內(nèi)腔中,研究者在用Triton X-100破壞囊泡膜之前和之后都用蛋白酶K處理了sEVs,發(fā)現(xiàn)蛋白酶K能夠在添加去污劑前后消化與sEV相關(guān)的ADIPOQ。因此,ADIPOQ是位于這些sEV外膜上的白色脂肪細胞sEV的獨特標志物,有可能與 ADIPOQ受體結(jié)合并影響這些外泌體/sEVs的靶向性。

Fig.6 高分子量ADIPOQ在AdicerKO小鼠sEV中表達下調(diào)

 

04

結(jié)果總結(jié)

本研究對可代表重要代謝組織的五種細胞系進行定量蛋白質(zhì)組分析,發(fā)現(xiàn)每一種細胞類型都有獨特的sEV蛋白質(zhì)組表達模式。雖然 CD9/CD63/CD81等經(jīng)典sEV標志物的豐度差異很大,但研究者還確定了六種sEV標志物(ENO1、GPI、HSPA5、YWHAB、CSF1R 和CNTN1)。它們在所有細胞類型的sEV中豐度相似。此外,每種細胞類型都有特定的sEV標志物。使用白色脂肪組織減少和棕色脂肪組織增加的脂肪特異性Dicer敲除小鼠,研究者證實這些細胞類型特異性標志物可以預(yù)測血清sEV的變化起源。這些結(jié)果為了解在代謝穩(wěn)態(tài)中重要的細胞和組織的sEV蛋白質(zhì)組、識別獨特的sEV標志物以及證明這些標志物如何幫助預(yù)測血清sEV的組織來源提供了寶貴的資源。

 

參考文獻

Garcia-Martin, Ruben et al. “Tissue differences in the exosomal/small extracellular vesicle proteome and their potential as indicators of altered tissue metabolism.” Cell reports vol. 38,3 (2022): 110277.

發(fā)布者:上海生物芯片有限公司
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