Pazopanib (GW786034) 是多靶點(diǎn)抑制劑,抑制 VEGFR1,VEGFR2,VEGFR3,PDGFRβ,c-Kit,F(xiàn)GFR1,c-Fms的IC50分別為10,30,47,84,74,140,146 nM。
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生物活性
體外研究
Pazopanib 顯示出對(duì)所有人類(lèi) VEGFR 受體的良好效力,對(duì) VEGFR-1、-2 和-3 的 IC50 分別為 10、30 和 47 nM。還觀察到對(duì)密切相關(guān)的酪氨酸受體激酶 PDGFRβ、c-Kit、FGF-R1 和 c-fms 的顯著活性,IC50 分別為 84、74、140 和 146 nM。在細(xì)胞試驗(yàn)中,除了抑制 VEGF 誘導(dǎo)的 HUVEC 增殖外,Pazopanib 還有效抑制 VEGF 誘導(dǎo)的 HUVEC 細(xì)胞中 VEGFR-2 的磷酸化,IC50 約為 8 nM。Pazopanib 在大鼠、狗和猴子中具有良好的藥代動(dòng)力學(xué),分別在 10、1 和 5 mg/kg 時(shí)具有低清除率 (1.4-1.7 mL/min/kg) 和良好的口服生物利用度 (72%、47%、65%)。除了 2C9 (7.9 μM) 外,細(xì)胞色素 P450 譜也得到改善,對(duì)測(cè)試的同工酶的抑制 >10 μM。
MCE尚未獨(dú)立證實(shí)這些方法的準(zhǔn)確性。僅供參考。
體內(nèi)研究
用 100 mg/kg 的 Pazopanib 處理小鼠,每天兩次,持續(xù) 5 天,導(dǎo)致血管形成程度的顯著抑制。使用 HT29 (結(jié)腸癌)、A375P (黑色素瘤) 和 HN5 (頭頸癌) 腫瘤后,在攜帶已建立的人異種移植物 (200?250 mm3) 的小鼠中檢查 Pazopanib 的抗血管生成活性標(biāo)準(zhǔn)的三周療程。與 A375P 模型相比,HN5 和 HT29 異種移植物在所有劑量下的反應(yīng)都更好,A375P 模型歷來(lái)對(duì) VEGFR-2 抑制劑具有更強(qiáng)的耐藥性。作為支持觀察到的異種移植物生長(zhǎng)抑制是通過(guò)抗血管生成而非抗腫瘤機(jī)制發(fā)揮作用的證據(jù),在低于 10 μM 的濃度下未觀察到 Pazopanib 對(duì)這些在含血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的人類(lèi)腫瘤細(xì)胞系 (HT29、HN5、A375P) 的抗增殖活性。未觀察到對(duì)小鼠體重的顯著影響,并且在整個(gè)研究期間動(dòng)物看起來(lái)健康且活躍。相關(guān)推薦:
PP58是Src抑制劑
Pazopanib 滴眼液組粘附的白細(xì)胞數(shù)量低于未處理的糖尿病動(dòng)物,高于健康動(dòng)物。粘附在健康動(dòng)物視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)上的平均白細(xì)胞為 37.2±7.8,而糖尿病動(dòng)物的平均值為 102±15.6,比健康動(dòng)物高約 3 倍。用 0.5 % w/v Pazopanib 混懸液處理的動(dòng)物在其視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)中粘附了 69.5±9.5 個(gè)白細(xì)胞,這明顯低于糖尿病動(dòng)物。
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實(shí)驗(yàn)參考方法
激酶試驗(yàn)
采用純化的桿狀病毒表達(dá)谷胱甘肽- s-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白編碼人類(lèi)VEGFR受體激酶1、2或3的催化c端,在384孔微滴板上以均勻的時(shí)間分辨熒光(htf)格式進(jìn)行VEGFR酶檢測(cè)。將10 μL活化的VEGFR2激酶溶液[終濃度,1 nM酶在0.1 M 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)中,pH為7.5,含0.1 mg/mL牛血清白蛋白(BSA), 300 μM二硫硫糖醇(DTT)]加入10 μL底物溶液[終濃度,360 nM肽,(生物素-氨基己基- eeeeyfelvakkkk - nh2), 75 μM ATP, 10 μM MgCl2]和1 μL滴定化合物在DMSO中引起反應(yīng)。室溫下孵育60 min,加入20 μL 100 mM乙二胺四乙酸(EDTA)猝滅反應(yīng)。猝滅后,加入20 μL htf試劑(終濃度為15 nM鏈親素聯(lián)異藻藍(lán)蛋白,1 nM銪標(biāo)記抗磷酸酪氨酸抗體,用0.1 mg/mL BSA稀釋?zhuān)?.1 M HEPES, pH 7.5),孵育至少10 min。用Wallac Victor板讀板儀測(cè)量665 nM處的熒光,延時(shí)50 μs。
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細(xì)胞試驗(yàn)
使用市售試劑盒,采用5-溴-2-脫氧尿苷(BrdU)摻入法測(cè)定Pazopanib對(duì)細(xì)胞增殖的影響。HUVEC在含有5%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基中接種于1型膠原包被的96孔板中,在37°C, 5% CO2條件下孵育過(guò)夜。從細(xì)胞中抽吸培養(yǎng)基,在無(wú)血清培養(yǎng)基中加入不同濃度的Pazopanib到每孔中。30min后,在孔中加入VEGF (10 ng/mL)或bFGF (0.3 ng/mL)。細(xì)胞再孵育72 h,在孵育的最后18 ~ 24 h加入BrdU (10 μM)。在孵育結(jié)束時(shí),用ELISA檢測(cè)BrdU在細(xì)胞中的摻入情況。數(shù)據(jù)用方程描述的曲線擬合,y=Vmax(1?(x/(K+x))),其中K等于IC50。
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動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法
小鼠
在8 ~ 12周齡裸鼠體內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞懸液誘發(fā)腫瘤。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100 ~ 200 mm3時(shí),將小鼠隨機(jī)分為8組。帕唑帕尼每天給藥1次或2次,劑量分別為10、30或100 mg/kg。在研究結(jié)束時(shí),動(dòng)物被吸入二氧化碳安樂(lè)死。腫瘤體積每周用卡尺測(cè)量?jī)纱危褂霉剑耗[瘤體積(mm3)=(length×width2)/2。結(jié)果通常報(bào)告為%抑制率=1?(藥物處理群體的平均增長(zhǎng)/載體處理對(duì)照群體的平均增長(zhǎng))。
大鼠
雄性棕色-挪威(BN;體重200至250 g的色素大鼠在任何實(shí)驗(yàn)程序之前至少適應(yīng)兩天。禁食12-16小時(shí)后,腹腔注射鏈脲佐菌素溶液30 mg/mL,加入10 mM檸檬酸緩沖液(pH 4.5) (60 mg/kg體重)誘導(dǎo)糖尿病。注射鏈脲佐菌素后3 ~ 4 h,飼喂常規(guī)飼料,注射后24 h,尾靜脈采血(5 ~ 10 μL)。動(dòng)物的血糖水平是用血糖監(jiān)測(cè)器測(cè)定的。血糖水平超過(guò)250毫克/分升的動(dòng)物被認(rèn)為是糖尿病。這些動(dòng)物被分成三組。組1:健康(n=12),組2:糖尿。╪=12),組3:糖尿病+治療(n=12)。糖尿病誘導(dǎo)后立即開(kāi)始治療。用0.5% w/v Pazopanib混懸液(每只眼10 μL體積)每天給藥2次,連續(xù)30天,各組動(dòng)物于第31天、第30天末次給藥后16-17 h處死。
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