Pazopanib抑制劑

　　Pazopanib （GW786034） 是多靶點(diǎn)抑制劑，抑制 VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3，PDGFRβ，c-Kit，F(xiàn)GFR1，c-Fms的IC50分別為10，30，47，84，74，140，146 nM。

 

 

 

　　體外研究

 

　　Pazopanib 顯示出對(duì)所有人類(lèi) VEGFR 受體的良好效力，對(duì) VEGFR-1、-2 和-3 的 IC50 分別為 10、30 和 47 nM。還觀察到對(duì)密切相關(guān)的酪氨酸受體激酶 PDGFRβ、c-Kit、FGF-R1 和 c-fms 的顯著活性，IC50 分別為 84、74、140 和 146 nM。在細(xì)胞試驗(yàn)中，除了抑制 VEGF 誘導(dǎo)的 HUVEC 增殖外，Pazopanib 還有效抑制 VEGF 誘導(dǎo)的 HUVEC 細(xì)胞中 VEGFR-2 的磷酸化，IC50 約為 8 nM。Pazopanib 在大鼠、狗和猴子中具有良好的藥代動(dòng)力學(xué)，分別在 10、1 和 5 mg/kg 時(shí)具有低清除率 （1.4-1.7 mL/min/kg） 和良好的口服生物利用度 （72%、47%、65%）。除了 2C9 （7.9 μM） 外，細(xì)胞色素 P450 譜也得到改善，對(duì)測(cè)試的同工酶的抑制 >10 μM。

 

　　MCE尚未獨(dú)立證實(shí)這些方法的準(zhǔn)確性。僅供參考。

 

　　體內(nèi)研究

 

　　用 100 mg/kg 的 Pazopanib 處理小鼠，每天兩次，持續(xù) 5 天，導(dǎo)致血管形成程度的顯著抑制。使用 HT29 （結(jié)腸癌）、A375P （黑色素瘤） 和 HN5 （頭頸癌） 腫瘤后，在攜帶已建立的人異種移植物 （200?250 mm3） 的小鼠中檢查 Pazopanib 的抗血管生成活性標(biāo)準(zhǔn)的三周療程。與 A375P 模型相比，HN5 和 HT29 異種移植物在所有劑量下的反應(yīng)都更好，A375P 模型歷來(lái)對(duì) VEGFR-2 抑制劑具有更強(qiáng)的耐藥性。作為支持觀察到的異種移植物生長(zhǎng)抑制是通過(guò)抗血管生成而非抗腫瘤機(jī)制發(fā)揮作用的證據(jù)，在低于 10 μM 的濃度下未觀察到 Pazopanib 對(duì)這些在含血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的人類(lèi)腫瘤細(xì)胞系 （HT29、HN5、A375P） 的抗增殖活性。未觀察到對(duì)小鼠體重的顯著影響，并且在整個(gè)研究期間動(dòng)物看起來(lái)健康且活躍。相關(guān)推薦：PP58是Src抑制劑

 

　　Pazopanib 滴眼液組粘附的白細(xì)胞數(shù)量低于未處理的糖尿病動(dòng)物，高于健康動(dòng)物。粘附在健康動(dòng)物視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)上的平均白細(xì)胞為 37.2±7.8，而糖尿病動(dòng)物的平均值為 102±15.6，比健康動(dòng)物高約 3 倍。用 0.5 % w/v Pazopanib 混懸液處理的動(dòng)物在其視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)中粘附了 69.5±9.5 個(gè)白細(xì)胞，這明顯低于糖尿病動(dòng)物。

 

　　MCE尚未獨(dú)立證實(shí)這些方法的準(zhǔn)確性。僅供參考。

 

 

　　激酶試驗(yàn)

 

　　采用純化的桿狀病毒表達(dá)谷胱甘肽- s-轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白編碼人類(lèi)VEGFR受體激酶1、2或3的催化c端，在384孔微滴板上以均勻的時(shí)間分辨熒光（htf）格式進(jìn)行VEGFR酶檢測(cè)。將10 μL活化的VEGFR2激酶溶液[終濃度，1 nM酶在0.1 M 4-（2-羥乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）中，pH為7.5，含0.1 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）， 300 μM二硫硫糖醇（DTT）]加入10 μL底物溶液[終濃度，360 nM肽，（生物素-氨基己基- eeeeyfelvakkkk - nh2）， 75 μM ATP, 10 μM MgCl2]和1 μL滴定化合物在DMSO中引起反應(yīng)。室溫下孵育60 min，加入20 μL 100 mM乙二胺四乙酸（EDTA）猝滅反應(yīng)。猝滅后，加入20 μL htf試劑（終濃度為15 nM鏈親素聯(lián)異藻藍(lán)蛋白，1 nM銪標(biāo)記抗磷酸酪氨酸抗體，用0.1 mg/mL BSA稀釋?zhuān)?.1 M HEPES, pH 7.5），孵育至少10 min。用Wallac Victor板讀板儀測(cè)量665 nM處的熒光，延時(shí)50 μs。

 

 

　　細(xì)胞試驗(yàn)

 

　　使用市售試劑盒，采用5-溴-2-脫氧尿苷（BrdU）摻入法測(cè)定Pazopanib對(duì)細(xì)胞增殖的影響。HUVEC在含有5%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)基中接種于1型膠原包被的96孔板中，在37°C, 5% CO2條件下孵育過(guò)夜。從細(xì)胞中抽吸培養(yǎng)基，在無(wú)血清培養(yǎng)基中加入不同濃度的Pazopanib到每孔中。30min后，在孔中加入VEGF （10 ng/mL）或bFGF （0.3 ng/mL）。細(xì)胞再孵育72 h，在孵育的最后18 ~ 24 h加入BrdU （10 μM）。在孵育結(jié)束時(shí)，用ELISA檢測(cè)BrdU在細(xì)胞中的摻入情況。數(shù)據(jù)用方程描述的曲線擬合，y=Vmax（1?（x/（K+x））），其中K等于IC50。

 

　　MCE尚未獨(dú)立證實(shí)這些方法的準(zhǔn)確性。僅供參考。

 

　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法

 

　　小鼠

 

　　在8 ~ 12周齡裸鼠體內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞懸液誘發(fā)腫瘤。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100 ~ 200 mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為8組。帕唑帕尼每天給藥1次或2次，劑量分別為10、30或100 mg/kg。在研究結(jié)束時(shí)，動(dòng)物被吸入二氧化碳安樂(lè)死。腫瘤體積每周用卡尺測(cè)量?jī)纱危�使用公式：腫瘤體積（mm3）=（length×width2）/2。結(jié)果通常報(bào)告為%抑制率=1?（藥物處理群體的平均增長(zhǎng)/載體處理對(duì)照群體的平均增長(zhǎng)）。

 

　　大鼠

 

　　雄性棕色-挪威（BN;體重200至250 g的色素大鼠在任何實(shí)驗(yàn)程序之前至少適應(yīng)兩天。禁食12-16小時(shí)后，腹腔注射鏈脲佐菌素溶液30 mg/mL，加入10 mM檸檬酸緩沖液（pH 4.5） （60 mg/kg體重）誘導(dǎo)糖尿病。注射鏈脲佐菌素后3 ~ 4 h，飼喂常規(guī)飼料，注射后24 h，尾靜脈采血（5 ~ 10 μL）。動(dòng)物的血糖水平是用血糖監(jiān)測(cè)器測(cè)定的。血糖水平超過(guò)250毫克/分升的動(dòng)物被認(rèn)為是糖尿病。這些動(dòng)物被分成三組。組1:健康（n=12），組2:糖尿�。╪=12），組3:糖尿病+治療（n=12）。糖尿病誘導(dǎo)后立即開(kāi)始治療。用0.5% w/v Pazopanib混懸液（每只眼10 μL體積）每天給藥2次，連續(xù)30天，各組動(dòng)物于第31天、第30天末次給藥后16-17 h處死。

 

　　MCE尚未獨(dú)立證實(shí)這些方法的準(zhǔn)確性。僅供參考。