用于癌癥給藥的細(xì)胞/組織重組脂質(zhì)納米顆粒(rLNPs)的制備方法及潛力
介紹：
納米藥物是設(shè)計(jì)更好的藥物遞送系統(tǒng)（DDS）的一種有前景的方法，而基于細(xì)胞/組織的脂質(zhì)載體的開發(fā)是一種有前景的策略。在本研究中，作者提出了重組脂質(zhì)納米顆粒（rLNPs）的概念，并提供了一種簡單的制備方法。結(jié)果表明，從細(xì)胞（小鼠乳腺癌癥細(xì)胞系，4T1）和組織（小鼠肝組織）中制備超�。▇20nm）rLNP高度可再生。作為一個(gè)選定的模型平臺(tái)，來源于小鼠肝組織的rLNP可以進(jìn)一步用成像分子（吲哚菁綠和香豆素6）標(biāo)記，并用靶向配體（生物素）修飾。此外，rLNPs被證明具有高度的生物相容性，能夠負(fù)載各種藥物，如鹽酸阿霉素（Dox）和姜黃素（Cur）。最重要的是，Dox負(fù)載的rLNPs（rLNP/Dox）在體外和體內(nèi)都表現(xiàn)出良好的抗癌性能。因此，rLNPs可能是構(gòu)建不同DDS和治療多種疾病的潛在多功能載體。
制備：
材料：
鹽酸阿霉素Dox、姜黃素（Cur）、香豆素（C6）、吲哚菁綠（IGG）、甲基噻唑四氮唑（MTT）。DSPE-PEG2000-Biotin（艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司），其他沒有具體說明的化學(xué)品和試劑都是從阿拉丁購買，并且是分析級的。
艾偉拓AVT在售的DSPE-PEG2000-Biotin來自日本丘比的蛋黃卵磷脂，并且是以蛋黃粉為原料通過先進(jìn)工藝提取、純化的磷脂混合物。
選擇好的磷脂產(chǎn)品可以來艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司看一看，這是一家專營磷脂類高端藥用輔料的科技公司，公司旗下產(chǎn)品豐富，有著技術(shù)專家的專業(yè)支持，能夠及時(shí)的解決客戶問題，助力客戶價(jià)值的提升。
rLNPs的制備：
遵循先前報(bào)道的方案，從細(xì)胞和組織中提取全脂，并進(jìn)行修飾。簡而言之，將100 mg的新鮮組織（或5x107的細(xì)胞）切成片，裝入500 µL 含有75%甲醇的玻璃均質(zhì)器中。在0℃下研磨約50次后，將混合物轉(zhuǎn)移到含有另1 mL甲基叔丁基醚（MTBE）的棕色試管中，將試管放入搖床中1小時(shí)，以便充分提取脂質(zhì)，然后，向管中加入250 µL純水，靜置10min進(jìn)行相分離，然后在0℃下，15000xg離心15min，將含有濃縮脂質(zhì)的上部MTBE相轉(zhuǎn)移到另一個(gè)新的棕色試管中，并使用吹氮儀器進(jìn)行干燥。
將得到的脂質(zhì)溶解在乙醇中，達(dá)到指定的濃度。然后，根據(jù)文獻(xiàn)作者之前的研究，采用溶劑擴(kuò)散法，將乙醇溶液在攪拌（500rpm），以0.1 mL/s的恒定速率，通過注射器注入純水（體積比為：1：9）。
關(guān)于材料和方法的所有詳細(xì)信息請參考support information。
結(jié)果：
圖1：使用從4T1細(xì)胞和小鼠肝組織提取的脂質(zhì)制備的rLNP的尺寸分布（A，B）和形態(tài)觀察（C，D）。比例尺：200 nm。
圖2：4T1細(xì)胞中，未修飾（上）和生物素修飾（下）的C6標(biāo)記rLNP的時(shí)間依賴性細(xì)胞攝取譜。比例尺：50μm
圖3：rLNPs的生物相容性測定。（A）用不同濃度的rLNP處理1小時(shí)后2%紅細(xì)胞的溶血。插入的圖像顯示不同組的上清液。（B）小鼠的體重變化每隔一天靜脈注射rLNPs（100mg/kg），持續(xù)14天。數(shù)據(jù)顯示為三個(gè)獨(dú)立結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。（C）從給藥結(jié)束時(shí)從受體獲得的主要器官制備的HE組織病理學(xué)切片。比例尺：100μm。
圖4：rLNPs的體內(nèi)腫瘤積聚測定。將游離ICG（左）和ICG標(biāo)記的rLNP（右）靜脈注射到原位4T1荷瘤小鼠中，并通過實(shí)時(shí)成像觀察受試者在6（A）、24（B）和48小時(shí)（C）時(shí)的ICG信號分布。在注射后48小時(shí)，切除一名受試者的主要器官和腫瘤組織進(jìn)行離體成像（D）。（E） 靜脈內(nèi)給予游離Dox和rLNP/Dox（Dox劑量：5mg/kg）后4T1荷瘤小鼠的時(shí)間依賴性組織/血漿Dox濃度。Dox濃度分別表示為組織的μg/g組織和血漿的μg/mL。數(shù)據(jù)顯示為三個(gè)獨(dú)立結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差*P<0.05
圖6：rLNP/Dox的體外抗癌性能。（A） 孵育24小時(shí)后，游離Dox和rLNP/Dox對4T1細(xì)胞的濃度依賴性細(xì)胞毒性。數(shù)據(jù)顯示為三個(gè)獨(dú)立結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。（B） MCTS與游離Dox或rLNP/Dox（Dox濃度：1μg/mL）孵育4天后的圖像。比例尺：500μm。左側(cè)的定量結(jié)果表示MCTS的相應(yīng)體積
圖7：rLNP/Dox的體內(nèi)抗癌性能。（A） 腫瘤體積變化和（B）HE和Ki67染色后的離體腫瘤切片的代表性圖像。比例尺：100μm*P＜0.05。
結(jié)論：
總之，在本研究中，作者提出了rLNPs的概念和制備方法，并展示了其作為多功能藥物遞送載體的潛力。它們的優(yōu)點(diǎn)包括：（1）從細(xì)胞和組織制備的重復(fù)性高；（2） 用熒光分子進(jìn)行柔性標(biāo)記，并對靶向配體和可能的其他功能部分進(jìn)行修飾；（3） 高生物相容性；（4） 能夠裝載各種分子/藥物；以及（5）作為藥物載體具有良好的體外和體內(nèi)抗癌性能，這可以通過負(fù)載其他種類的藥物進(jìn)一步擴(kuò)展到治療其他疾病。在未來的工作中，作者將重點(diǎn)關(guān)注以下幾個(gè)方面：（1）將rLNPs的應(yīng)用擴(kuò)展到不同的藥物和其他疾病模型；（2） 探討rLNPs是否具有細(xì)胞/組織特異性功能；和（3）闡明是否可以使用rLNP實(shí)現(xiàn)細(xì)胞/組織訓(xùn)練，因?yàn)樗鼈儼阁w細(xì)胞/組織的脂質(zhì)組學(xué)。
納米藥物是設(shè)計(jì)更好的藥物遞送系統(tǒng)（DDS）的一種有前景的方法，而基于細(xì)胞/組織的脂質(zhì)載體的開發(fā)是一種有前景的策略。在本研究中，作者提出了重組脂質(zhì)納米顆粒（rLNPs）的概念，并提供了一種簡單的制備方法。結(jié)果表明，從細(xì)胞（小鼠乳腺癌癥細(xì)胞系，4T1）和組織（小鼠肝組織）中制備超�。▇20nm）rLNP高度可再生。作為一個(gè)選定的模型平臺(tái)，來源于小鼠肝組織的rLNP可以進(jìn)一步用成像分子（吲哚菁綠和香豆素6）標(biāo)記，并用靶向配體（生物素）修飾。此外，rLNPs被證明具有高度的生物相容性，能夠負(fù)載各種藥物，如鹽酸阿霉素（Dox）和姜黃素（Cur）。最重要的是，Dox負(fù)載的rLNPs（rLNP/Dox）在體外和體內(nèi)都表現(xiàn)出良好的抗癌性能。因此，rLNPs可能是構(gòu)建不同DDS和治療多種疾病的潛在多功能載體。
制備：
材料：
鹽酸阿霉素Dox、姜黃素（Cur）、香豆素（C6）、吲哚菁綠（IGG）、甲基噻唑四氮唑（MTT）。DSPE-PEG2000-Biotin（艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司），其他沒有具體說明的化學(xué)品和試劑都是從阿拉丁購買，并且是分析級的。
艾偉拓AVT在售的DSPE-PEG2000-Biotin來自日本丘比的蛋黃卵磷脂，并且是以蛋黃粉為原料通過先進(jìn)工藝提取、純化的磷脂混合物。
選擇好的磷脂產(chǎn)品可以來艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司看一看，這是一家專營磷脂類高端藥用輔料的科技公司，公司旗下產(chǎn)品豐富，有著技術(shù)專家的專業(yè)支持，能夠及時(shí)的解決客戶問題，助力客戶價(jià)值的提升。
rLNPs的制備：
遵循先前報(bào)道的方案，從細(xì)胞和組織中提取全脂，并進(jìn)行修飾。簡而言之，將100 mg的新鮮組織（或5x107的細(xì)胞）切成片，裝入500 µL 含有75%甲醇的玻璃均質(zhì)器中。在0℃下研磨約50次后，將混合物轉(zhuǎn)移到含有另1 mL甲基叔丁基醚（MTBE）的棕色試管中，將試管放入搖床中1小時(shí)，以便充分提取脂質(zhì)，然后，向管中加入250 µL純水，靜置10min進(jìn)行相分離，然后在0℃下，15000xg離心15min，將含有濃縮脂質(zhì)的上部MTBE相轉(zhuǎn)移到另一個(gè)新的棕色試管中，并使用吹氮儀器進(jìn)行干燥。
將得到的脂質(zhì)溶解在乙醇中，達(dá)到指定的濃度。然后，根據(jù)文獻(xiàn)作者之前的研究，采用溶劑擴(kuò)散法，將乙醇溶液在攪拌（500rpm），以0.1 mL/s的恒定速率，通過注射器注入純水（體積比為：1：9）。
關(guān)于材料和方法的所有詳細(xì)信息請參考support information。
結(jié)果：
圖1：使用從4T1細(xì)胞和小鼠肝組織提取的脂質(zhì)制備的rLNP的尺寸分布（A，B）和形態(tài)觀察（C，D）。比例尺：200 nm。圖2：4T1細(xì)胞中，未修飾（上）和生物素修飾（下）的C6標(biāo)記rLNP的時(shí)間依賴性細(xì)胞攝取譜。比例尺：50μm圖3：rLNPs的生物相容性測定。（A）用不同濃度的rLNP處理1小時(shí)后2%紅細(xì)胞的溶血。插入的圖像顯示不同組的上清液。（B）小鼠的體重變化每隔一天靜脈注射rLNPs（100mg/kg），持續(xù)14天。數(shù)據(jù)顯示為三個(gè)獨(dú)立結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。（C）從給藥結(jié)束時(shí)從受體獲得的主要器官制備的HE組織病理學(xué)切片。比例尺：100μm。圖4：rLNPs的體內(nèi)腫瘤積聚測定。將游離ICG（左）和ICG標(biāo)記的rLNP（右）靜脈注射到原位4T1荷瘤小鼠中，并通過實(shí)時(shí)成像觀察受試者在6（A）、24（B）和48小時(shí)（C）時(shí)的ICG信號分布。在注射后48小時(shí)，切除一名受試者的主要器官和腫瘤組織進(jìn)行離體成像（D）。（E） 靜脈內(nèi)給予游離Dox和rLNP/Dox（Dox劑量：5mg/kg）后4T1荷瘤小鼠的時(shí)間依賴性組織/血漿Dox濃度。Dox濃度分別表示為組織的μg/g組織和血漿的μg/mL。數(shù)據(jù)顯示為三個(gè)獨(dú)立結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差*P<0.05圖6：rLNP/Dox的體外抗癌性能。（A） 孵育24小時(shí)后，游離Dox和rLNP/Dox對4T1細(xì)胞的濃度依賴性細(xì)胞毒性。數(shù)據(jù)顯示為三個(gè)獨(dú)立結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。（B） MCTS與游離Dox或rLNP/Dox（Dox濃度：1μg/mL）孵育4天后的圖像。比例尺：500μm。左側(cè)的定量結(jié)果表示MCTS的相應(yīng)體積圖7：rLNP/Dox的體內(nèi)抗癌性能。（A） 腫瘤體積變化和（B）HE和Ki67染色后的離體腫瘤切片的代表性圖像。比例尺：100μm*P＜0.05。結(jié)論：
總之，在本研究中，作者提出了rLNPs的概念和制備方法，并展示了其作為多功能藥物遞送載體的潛力。它們的優(yōu)點(diǎn)包括：（1）從細(xì)胞和組織制備的重復(fù)性高；（2） 用熒光分子進(jìn)行柔性標(biāo)記，并對靶向配體和可能的其他功能部分進(jìn)行修飾；（3） 高生物相容性；（4） 能夠裝載各種分子/藥物；以及（5）作為藥物載體具有良好的體外和體內(nèi)抗癌性能，這可以通過負(fù)載其他種類的藥物進(jìn)一步擴(kuò)展到治療其他疾病。在未來的工作中，作者將重點(diǎn)關(guān)注以下幾個(gè)方面：（1）將rLNPs的應(yīng)用擴(kuò)展到不同的藥物和其他疾病模型；（2） 探討rLNPs是否具有細(xì)胞/組織特異性功能；和（3）闡明是否可以使用rLNP實(shí)現(xiàn)細(xì)胞/組織訓(xùn)練，因?yàn)樗鼈儼阁w細(xì)胞/組織的脂質(zhì)組學(xué)。
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