常用的報告基因及報告基因工具鼠的構(gòu)建方法介紹

前言
在生物醫(yī)學研究中，精準定位想要研究的目的基因或細胞是至關(guān)重要的。為了實現(xiàn)這一目標，報告基因工具鼠成為了不可或缺的研究工具。然而，面對種類如此繁多的報告基因工具鼠，“科研汪”們早已眼花繚亂，選擇困難癥都犯了...別怕，小編今天就來為您答疑解惑啦！希望能幫您找到合適的“小幫手”，順利開啟科研之路！

什么是報告基因工具鼠？
報告基因工具鼠，顧名思義就是攜帶報告基因（reporter gene）的小鼠模型，它是利用基因工程技術(shù)手段，將報告基因整合到小鼠的基因組中構(gòu)建而成。當報告基因表達時，我們可以借助實驗儀器觀察到其在組織或細胞水平的表達情況，從而實現(xiàn)在體內(nèi)進行基因表達監(jiān)測、細胞標記和譜系示蹤等研究。

報告基因工具鼠在許多研究領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用。在發(fā)育生物學研究中，研究人員可以利用報告基因工具鼠來觀察特定基因在胚胎發(fā)育過程中的表達模式，從而揭示胚胎發(fā)育的機制。在神經(jīng)科學領(lǐng)域，報告基因工具鼠可以幫助科學家研究神經(jīng)元的發(fā)育和連接，揭示大腦功能和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的機制。在免疫學研究中，報告基因工具鼠可以用來研究免疫細胞的分化和活化過程，探索免疫應(yīng)答的調(diào)控機制。
 

圖1. 報告基因工具鼠的部分應(yīng)用場景[1]

體內(nèi)研究常用的報告基因有哪些？
報告基因是那些能編碼某種易于檢測蛋白質(zhì)或酶的基因，通過它的表達產(chǎn)物便捷、可靠、靈敏的來標定目的基因的表達調(diào)控。體內(nèi)研究常用的報告基因包括β-半乳糖苷酶、熒光蛋白、熒光素酶等。
 

β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）由大腸埃希菌LacZ基因編碼，是一種由四個四聚體組成的酶，每個四聚體的分子量為465kDa，可將無色化合物X-gal切割成半乳糖和深藍色物質(zhì)：5-溴-4-靛藍。β-ga1常用于整體胚胎或組織切片的基因表達研究，因為利用β-gal進行胚胎的全身染色，可以充分了解某一基因在體內(nèi)的表達譜全貌。
 

圖2. 利用lacZ檢測Lgr5基因的表達情況[6]
 

熒光蛋白

熒光蛋白家族（fluorescent protein family）是從水螅蟲綱和珊瑚類動物中發(fā)現(xiàn)的相對分子質(zhì)量為(2～3)×104的同源蛋白，包括綠色、紅色、黃色和青色熒光蛋白等，其中綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是應(yīng)用最多的熒光蛋白。

熒光蛋白的發(fā)光原理在于其發(fā)色基團經(jīng)一定波長的光（激發(fā)光）照射后被激活，并將能量以光能形式釋放，這時我們就能在熒光顯微鏡下看到日思夜想的熒光色啦！熒光蛋白常用于研究目的基因表達，蛋白質(zhì)運輸以及各種細胞內(nèi)動態(tài)的生物化學信號通路等。
 

圖3. 利用熒光蛋白研究心臟發(fā)育或再生機制[7]
 

熒光素酶

熒光素酶（luciferase）是生物體內(nèi)催化不同底物(如熒光素、腔腸素等)發(fā)射出熒光或催化脂肪醛氧化發(fā)光的一類酶的總稱，其中最具代表性的是螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase，F(xiàn)luc）和海腎熒光素酶（renilla luciferase，Rluc）。

螢光素酶可以催化自身底物氧化，在氧化過程中，一部分能量以光子形式被釋放，從而發(fā)出生物熒光。只有活細胞內(nèi)才會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，且光的強度與標記細胞的數(shù)目成正比。因此，熒光素酶自發(fā)光的活體成像技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生命科學、醫(yī)學研究及藥物開發(fā)等領(lǐng)域。
 

圖4. 活體成像示蹤Il1a細胞因子的表達。
 

不同類型報告基因具有各自的優(yōu)缺點（見表1）。在實際運用中，須結(jié)合研究的目的、信號檢測的時間性與空間性、首選的檢測方法、組織與細胞的類別等選擇適合的報告基因系統(tǒng)。

表1.體內(nèi)研究常用報告基因的優(yōu)缺點

如何將報告基因整合到小鼠基因組中？
一般而言，將外源基因引入小鼠基因組的方法有兩種：轉(zhuǎn)基因和基因敲入。

1.轉(zhuǎn)基因
(1) 隨機轉(zhuǎn)基因
將含有報告基因的外源DNA片段克隆至PiggyBac（PB）轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒中，與轉(zhuǎn)座酶一起注射到小鼠受精卵中。在轉(zhuǎn)座酶作用下，外源DNA片段將會被整合到基因組上的TTAA位點處，從而獲得表達報告基因的小鼠。
 

圖5. PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)
 

雖然利用PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將外源基因敲入在轉(zhuǎn)座酶識別位點，可以提高轉(zhuǎn)基因的表達陽性率，但依然避免不了隨機轉(zhuǎn)基因隨機整合的缺點。難道就沒有一種既能明確而準確地插入外源基因又能保證表達的方法嗎？答案是有的，那就是小編接下來要介紹的定點轉(zhuǎn)基因。

(2) 定點轉(zhuǎn)基因
定點轉(zhuǎn)基因的關(guān)鍵就在于“定點”，Rosa26位點是目前最為常用的定點整合位點之一，將攜帶報告基因的DNA序列插入到小鼠的Rosa26位點上，可以保證報告基因在小鼠體內(nèi)穩(wěn)定表達。

在組成型表達的基礎(chǔ)上，我們還可以借助重組酶系統(tǒng)構(gòu)建條件性表達報告基因的小鼠模型。以Cre/loxP系統(tǒng)為例，首先在啟動子和報告基因之間插入轉(zhuǎn)錄終止盒（lox-stop-lox）構(gòu)建Flox鼠，同時構(gòu)建特異性Cre鼠（由特定啟動子驅(qū)動，可在特定細胞或組織表達Cre重組酶）。將上述兩種小鼠交配后，子代中可以獲得既帶有Cre又帶有Flox基因的小鼠，在表達Cre重組酶的細胞或組織中，終止盒被Cre重組酶切除，因此僅在這些細胞或組織中才會表達報告基因。
 

圖6. 條件性表達報告基因小鼠的構(gòu)建示意圖[8]

2.基因敲入
與轉(zhuǎn)基因不同，基因敲入是在小鼠內(nèi)源基因的特定位點插入報告基因，可以更好地研究該基因的功能和調(diào)控機制。想要將外源報告基因敲入小鼠的內(nèi)源基因，有以下三種方式：
 

圖7. 基因敲入方式構(gòu)建報告基因工具鼠策略圖。

融合表達
將報告基因敲入到小鼠內(nèi)源基因的5'端或3'端，與內(nèi)源基因融合表達。

共表達
共表達的構(gòu)建方式是將報告基因通過2A（自剪切多肽）或IRES（內(nèi)部核糖體進入位點序列）元件敲入到小鼠內(nèi)源基因的3'端。

取代表達
取代表達的構(gòu)建方式則是用報告基因取代小鼠本身的基因，使敲除和敲入同時發(fā)生。

想必大家在選用共表達時，還會糾結(jié)IRES和2A元件要怎么選擇。小編對IRES和2A元件的優(yōu)缺點進行了簡要總結(jié)，供大家參考~

1  IRES
優(yōu)點：IRES上下游的兩個蛋白可以同時表達，并且翻譯出的兩個蛋白是完全獨立的。
缺點：IRES的序列較長（約600bp），其應(yīng)用常受到載體容量的限制。此外，IRES前后兩個蛋白無法實現(xiàn)等量表達。通常情況下，下游蛋白的表達量僅為上游蛋白的10%~50%。

2  2A
優(yōu)點：2A肽長度小且剪切效率極高，能夠?qū)崿F(xiàn)多蛋白的等量表達。
缺點：上游蛋白會多出20余個氨基酸的多肽尾巴，下游蛋白會在N端多出一個脯氨酸。這種額外增加的2A肽結(jié)構(gòu)可能會對目的蛋白的功能造成一定的影響。

圖8. 連接元件IRES和2A的作用原理[9]

由于IRES和2A肽都有著各自的優(yōu)缺點，建議參考目的蛋白的相關(guān)文獻報道，或依照經(jīng)驗進行構(gòu)建。

Reference：
[1] Kasatkina LA, Verkhusha VV. Transgenic mice encoding modern imaging probes: Properties and applications. Cell Rep. 2022;39(8):110845. doi:10.1016/j.celrep.2022.110845

[2] Li S, Chen LX, Peng XH, et al. Overview of the reporter genes and reporter mouse models. Animal Model Exp Med. 2018;1(1):29-35. Published 2018 Apr 19. doi:10.1002/ame2.12008

[3] Abe T, Fujimori T. Reporter mouse lines for fluorescence imaging. Dev Growth Differ. 2013;55(4):390-405. doi:10.1111/dgd.12062

[4] Spergel DJ, Krüth U, Shimshek DR, Sprengel R, Seeburg PH. Using reporter genes to label selected neuronal populations in transgenic mice for gene promoter, anatomical, and physiological studies. Prog Neurobiol. 2001;63(6):673-686. doi:10.1016/s0301-0082(00)00038-1

[5] 張禾璇,單可人,官志忠.報告基因研究及其應(yīng)用進展[J].國際遺傳學雜志, 2013, 36(1):7.DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4386.2013.01.002.

[6] Barker N, van Es JH, Kuipers J, et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 2007;449(7165):1003-1007. doi:10.1038/nature06196

[7] Li Y, Lv Z, He L, et al. Genetic Tracing Identifies Early Segregation of the Cardiomyocyte and Nonmyocyte Lineages. Circ Res. 2019;125(3):343-355. doi:10.1161/CIRCRESAHA.119.315280

[8] Cazemier JL, Clascá F, Tiesinga PH. Connectomic Analysis of Brain Networks: Novel Techniques and Future Directions. Front Neuroanat. 2016;10:110. Published 2016 Nov 9. doi:10.3389/fnana.2016.00110

[9] Gurumurthy CB, Saunders TL, Ohtsuka M. Designing and generating a mouse model: frequently asked questions. J Biomed Res. 2021;35(2):76-90. doi:10.7555/JBR.35.2020019