譜系示蹤系列第二期之單重組酶介導(dǎo)的多色報(bào)告系統(tǒng)方法

細(xì)胞譜系追蹤技術(shù)通常是指使用各種手段對(duì)某類祖細(xì)胞亞群進(jìn)行標(biāo)記，在后續(xù)時(shí)間點(diǎn)對(duì)其分化命運(yùn)進(jìn)行檢測(cè)，它對(duì)于揭開多樣的、基礎(chǔ)的生物學(xué)過程中的分子機(jī)制是非常關(guān)鍵，因此一直以來建立能夠在體內(nèi)進(jìn)行追蹤細(xì)胞譜系的動(dòng)物模型是生物學(xué)研究的一個(gè)長期目標(biāo)。

根據(jù)重組類型和數(shù)量，基因重組系統(tǒng)可以分為傳統(tǒng)的單重組酶介導(dǎo)的遺傳方法與更復(fù)雜的單重組酶介導(dǎo)的多色報(bào)告系統(tǒng)方法和多重組酶介導(dǎo)的遺傳方法，本期鼠博士為大家講解單重組酶介導(dǎo)的多色報(bào)告系統(tǒng)。

上期推文：【譜系示蹤系列第一期】基礎(chǔ)細(xì)胞標(biāo)記方式

單重組酶介導(dǎo)的單色報(bào)告基因就是最基礎(chǔ)的使用Cre-loxp系統(tǒng)進(jìn)行譜系示蹤，該技術(shù)的關(guān)鍵在于評(píng)估驅(qū)動(dòng)Cre的啟動(dòng)子的表達(dá)位置。而Cre-loxP系統(tǒng)的多色報(bào)告基因可用于單細(xì)胞標(biāo)記和克隆分析，為單細(xì)胞增殖、分化后的命運(yùn)提供了有價(jià)值的信息。這種報(bào)告系統(tǒng)也被稱之為“Brainbow”系統(tǒng)。
 

1 該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，表達(dá)紅色熒光RFP。RFP序列后的Poly A（圖示為pA）會(huì)介導(dǎo)基因停止表達(dá)，后續(xù)的元件均不表達(dá)，因而細(xì)胞呈現(xiàn)紅色。

當(dāng)Cre酶表達(dá)時(shí)，該系統(tǒng)會(huì)出現(xiàn)兩種可能發(fā)生的情況：
1 序列中存在兩個(gè)同向的loxP位點(diǎn)（圖中黑色三角形），Cre酶會(huì)切除兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間的序列（紅色熒光RFP序列被切除）。之后，該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，表達(dá)黃色熒光YFP。YFP序列后的Poly A（圖示為pA）會(huì)介導(dǎo)基因停止表達(dá)，后續(xù)的元件均不表達(dá)，因而細(xì)胞呈現(xiàn)黃色。

2 序列中存在兩個(gè)同向的lox2272位點(diǎn)（圖中斜條紋三角形），Cre酶會(huì)切除兩個(gè)lox2272位點(diǎn)之間的序列（紅色熒光RFP序列與黃色熒光YFP序列被切除）。之后，該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，表達(dá)藍(lán)色熒光M-CFP，因而細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色。

因此，細(xì)胞可能存在三種顏色：紅色（cre未表達(dá)）；黃色、藍(lán)色（cre表達(dá)）

當(dāng)無Cre酶表達(dá)時(shí)：

1 該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，表達(dá)橙色熒光OFP。OFP序列后的Poly A（圖示為pA）會(huì)介導(dǎo)基因停止表達(dá)，后續(xù)的元件均不表達(dá)，因而細(xì)胞呈現(xiàn)橙色。

當(dāng)Cre酶表達(dá)時(shí)，該系統(tǒng)會(huì)出現(xiàn)三種可能發(fā)生的情況：

1 序列中存在兩個(gè)同向的loxN位點(diǎn)（圖中斑點(diǎn)色三角形），Cre酶會(huì)切除兩個(gè)loxN位點(diǎn)之間的序列（橙色熒光OFP序列被切除）。之后，該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，表達(dá)紅色熒光M-RFP。M-RFP序列后的Poly A（圖示為pA）會(huì)介導(dǎo)基因停止表達(dá)，后續(xù)的元件均不表達(dá)，因而細(xì)胞呈現(xiàn)紅色。

2 序列中存在兩個(gè)同向的lox2272位點(diǎn)（圖中斜條紋三角形），Cre酶會(huì)切除兩個(gè)lox2272位點(diǎn)之間的序列（橙色熒光OFP序列與紅色熒光M-RFP序列被切除）。之后，該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，表達(dá)黃色熒光M-YFP，M-YFP序列后的Poly A（圖示為pA）會(huì)介導(dǎo)基因停止表達(dá)，后續(xù)的元件均不表達(dá)，因而細(xì)胞呈現(xiàn)黃色。

3 序列中存在兩個(gè)同向的loxP位點(diǎn)（圖中黑色三角形），Cre酶會(huì)切除兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間的序列（橙色熒光OFP序列、紅色熒光M-RFP序列與黃色熒光M-YFP序列被切除）。之后，該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，表達(dá)藍(lán)色熒光M-CFP，因而細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色。

因此，細(xì)胞可能存在三種顏色：橙色（cre未表達(dá)）；紅色、黃色、藍(lán)色（cre表達(dá)）。

當(dāng)無Cre酶表達(dá)時(shí)：

1 該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，表達(dá)綠色熒光nGFP。nGFP序列后的Poly A（圖示為pA）會(huì)介導(dǎo)基因停止表達(dá)，后續(xù)的元件均不表達(dá)，因而細(xì)胞呈現(xiàn)綠色。

當(dāng)Cre酶表達(dá)時(shí)，該系統(tǒng)會(huì)出現(xiàn)四種可能發(fā)生的情況：

a. LoxP位點(diǎn)①與③為同向，Cre酶切除①與③位點(diǎn)之間的序列（綠色熒光nGFP序列與黃色熒光YFP序列被切除），并介導(dǎo)反向的loxP位點(diǎn)③與④之間進(jìn)行倒轉(zhuǎn)：

1 倒轉(zhuǎn)發(fā)生奇數(shù)次。該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，表達(dá)藍(lán)色熒光M-CFP。M-CFP序列后的Poly A（圖示為pA）會(huì)介導(dǎo)基因停止表達(dá)，后續(xù)的元件均不表達(dá)，因而細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色。

2 倒轉(zhuǎn)發(fā)生偶數(shù)次。該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，表達(dá)紅色熒光RFP。RFP序列后的Poly A（圖示為pA）會(huì)介導(dǎo)基因停止表達(dá)，后續(xù)的元件均不表達(dá)，因而細(xì)胞呈現(xiàn)紅色。

b. loxP位點(diǎn)②與④為同向，Cre酶切除②與④位點(diǎn)之間的序列（紅色熒光RFP序列與藍(lán)色熒光M-CFP序列被切除），并介導(dǎo)反向的loxP位點(diǎn)①與②之間進(jìn)行倒轉(zhuǎn)：

3 倒轉(zhuǎn)發(fā)生偶數(shù)次。該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，表達(dá)綠色熒光nGFP。nGFP序列后的Poly A（圖示為pA）會(huì)介導(dǎo)基因停止表達(dá)，后續(xù)的元件均不表達(dá)，因而細(xì)胞呈現(xiàn)綠色。

4 倒轉(zhuǎn)發(fā)生奇數(shù)次。該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，表達(dá)黃色熒光YFP。YFP序列后的Poly A（圖示為pA）會(huì)介導(dǎo)基因停止表達(dá)，后續(xù)的元件均不表達(dá)，因而細(xì)胞呈現(xiàn)黃色。

因此，細(xì)胞可能存在四種顏色：綠色（cre未表達(dá)）；藍(lán)色、紅色、綠色、藍(lán)色（cre表達(dá)）。

使用 Brainbow系統(tǒng)對(duì)小鼠特定組織的單細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記后，即可根據(jù)顏色對(duì)終點(diǎn)細(xì)胞進(jìn)行分組，從而實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平的譜系譜系示蹤。

上述單重組酶報(bào)告基因系統(tǒng)只能依賴一個(gè)Maker來定位我們的目的細(xì)胞，但隨著細(xì)胞分類的不斷深入，我們往往需要兩個(gè)甚至兩個(gè)以上的Maker才能準(zhǔn)確定位我們想要研究的細(xì)胞群體，這時(shí)標(biāo)記細(xì)胞就需要使用到多重組酶介導(dǎo)的遺傳方法，下一期鼠博士為大家講解多重組酶介導(dǎo)的多色報(bào)告系統(tǒng)。

Reference：
[1] Livet, J., Weissman, T., Kang, H. et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature 450, 56–62 (2007). https://doi.org/10.1038/nature06293

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