熒光素酶報告系統(tǒng)在腫瘤細胞系構(gòu)建和研究中的應用及優(yōu)勢

瀏覽次數(shù)：1345　發(fā)布日期：2024-1-9　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責任自負

盡管有些腫瘤或疾病確實是由于基因組本身遺傳信息改變所致，但是表觀調(diào)控有時能更好地闡述腫瘤或疾病發(fā)生的機制。在課題進展中，尤其是在確定表型之后，我們往往從表觀調(diào)控，或轉(zhuǎn)錄調(diào)控，或蛋白修飾的方向去研究表型發(fā)生的機制。差異基因與表型間的關(guān)系往往是比較容易確定的，機制的挖掘則相對復雜！熒光素酶報告系統(tǒng)（Luciferase reporter）是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用的一種檢測方法。作為機制研究利器，如果我們想要研究某個轉(zhuǎn)錄因子是否能與某一靶啟動子片段有作用。首先將靶基因啟動子或其他待研究基因調(diào)控元件插入到熒光素酶報告基因前方，構(gòu)建成報告基因質(zhì)粒。然后，將可以表達待檢測轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞；如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達，熒光素酶的表達量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強度成正比；再加入特定熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應，產(chǎn)生熒光。通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。下面小編就給大家介紹一篇熒光素酶在腫瘤機制研究中的應用案例實驗步驟。

第一步：穩(wěn)轉(zhuǎn)熒光素酶（Luc）基因的腫瘤細胞系構(gòu)建

這篇文章采用的是慢病毒遞送的方式，也是目前構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的主流方法。用含有Luciferase基因的慢病毒質(zhì)粒+MD2G+psPAX2，三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，48-72小時收細胞上清，然后用去除細胞碎片的慢病毒感染腫瘤細胞。感染48-72小時后，用WB或流式或熒光顯微鏡驗證轉(zhuǎn)導效率。這里同時插入了Luc和EGFP，中間用IRES隔開，Luc和GFP獨立表達，非常巧妙，當然也是常用的實驗手段。

第二步：穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的驗證

作者同時插入了Luc和GFP，因此下面同時用了流式檢測GFP陽性率和用熒光素酶檢測試劑盒檢測了Luc的表達水平。因為有時候慢病毒整合的位點和拷貝數(shù)不一樣，會破壞宿主基因的表達，可能出現(xiàn)一些好的克隆和差的克隆。作者挑取了3個克隆，從流式和Luc檢測結(jié)果來看，#12克隆最好。

在此，建議大家在做穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的時候，至少要挑選和嘗試3個以上的克隆~

流式細胞術(shù)評價腫瘤細胞系的轉(zhuǎn)導

熒光素酶表達驗證

第三步：體內(nèi)腫瘤模型的建立

此外，作者還進行了皮下接種（subcutaneous，s.c.）和靜脈注射（intravenous，i.v.）穩(wěn)轉(zhuǎn)的腫瘤細胞系，并分別在接種后第7天和第10天進行體內(nèi)成像。與體外結(jié)果一致，#12克隆誘導腫瘤的效果最好。到這里已經(jīng)成功建立了小鼠腫瘤模型，后面就可以用作腫瘤治療或敲除的模型了。