豬偽狂犬病毒（PRV-gB） 蛋白的分子結構及制備策略

豬偽狂犬病毒（PRV）屬于皰疹病毒科 α 皰疹病毒亞科，其基因組編碼 11 種糖蛋白，其中 gB（糖蛋白 B）是病毒包膜的主要結構蛋白，具有以下核心功能：

• 病毒入侵關鍵因子：gB 與宿主細胞表面受體（如 nectin-1、HVEM）結合，介導病毒包膜與宿主細胞膜的融合，是病毒感染的必需蛋白。
• 免疫原性核心抗原：gB 蛋白可誘導機體產(chǎn)生中和抗體及細胞免疫，是疫苗設計的主要靶點之一。

1. 氨基酸序列與結構域劃分

   • PRV gB 基因全長約 3.8 kb，編碼 1195-1205 個氨基酸（不同毒株略有差異），前 18-22 個氨基酸為信號肽，C 端 20-30 個氨基酸為跨膜區(qū)，其余為胞外區(qū)。
   • 胞外區(qū)結構域： 
     • DⅠ 區(qū)（N 端結構域）：含保守的融合肽（fusion peptide），參與膜融合；
     • DⅡ 區(qū)（中部結構域）：含多個 β 折疊和二硫鍵，維持蛋白構象穩(wěn)定性；
     • DⅢ 區(qū)（C 端結構域）：含免疫優(yōu)勢表位，是中和抗體的主要結合區(qū)域。

2. 三維結構與功能關聯(lián)

   • gB 蛋白以同源三聚體形式存在于病毒包膜上，電鏡下呈 “柱狀” 結構，高度糖基化（約 12-15 個 N - 糖基化位點）。
   • 關鍵功能位點： 
     • 融合肽區(qū)（aa 40-60）：保守疏水氨基酸（如 Leu、Ile）突變可導致病毒感染力顯著下降；
     • 二硫鍵（如 Cys100-Cys150、Cys200-Cys250）：維持 DⅠ-DⅡ 區(qū)空間構象，缺失會破壞三聚體組裝。

• 理論分子量：未糖基化的 gB 蛋白多肽鏈約 130 kDa，但因廣泛糖基化，天然 gB 蛋白在 SDS-PAGE 中遷移至 150-180 kDa。
• 糖基化差異： 
  • 強毒株（如 Bartha-K61 疫苗株）與野毒株（如 TJ 株）的 gB 糖基化模式存在差異，野毒株可能因糖基化位點增加（如 N300、N500 位點）導致分子量更大，免疫逃逸能力增強。

• 難點：gB 胞外區(qū)含大量疏水結構域，在大腸桿菌中易形成包涵體，且缺乏糖基化導致抗原性降低。
• 改進方案： 
  • 分段表達：將 DⅢ 區(qū)（aa 800-1200）單獨表達，利用 pET-28a 載體融合 Trx 標簽（減少聚集）；
  • 體外糖基化模擬：通過化學方法在重組蛋白的 Ser/Thr 位點連接聚糖，改善抗原構象。

• 親和層析：利用 gB 蛋白 C 端 His 標簽（需避免破壞跨膜區(qū)），采用 Ni-NTA 樹脂，200 mM 咪唑洗脫，純度可達 95% 以上；
• 復性優(yōu)化：包涵體溶解后，通過梯度降低尿素濃度（8 M→1 M）并添加氧化還原對（GSH/GSSG=10:1），促進二硫鍵正確折疊。

1. 疫苗研發(fā)中的核心地位

• 傳統(tǒng)滅活疫苗與亞單位疫苗：以 gB 蛋白為主要抗原，如 Bartha-K61 株 gB 蛋白與佐劑聯(lián)用，可誘導高效中和抗體，但對變異株保護力有限。
• 基因工程疫苗： 
  • 重組活載體疫苗：將 gB 基因插入痘病毒載體，構建多價疫苗；
  • 病毒樣顆粒（VLP）疫苗：共表達 gB、gD、gH 蛋白，組裝成 VLP，免疫原性優(yōu)于單一蛋白。

2. 診斷試劑的創(chuàng)新應用

• ELISA 檢測：以重組 gB 蛋白為包被抗原，可區(qū)分自然感染與疫苗免疫（如鑒別 Bartha-K61 株 gB 與野毒株 gB 的抗原表位差異）；
• 中和試驗：利用 gB 蛋白特異性單克隆抗體（如針對 DⅢ 區(qū) aa 1000-1100 表位的抗體）建立中和阻斷 ELISA，提高變異株檢測靈敏度。

1. 野毒株 gB 的序列變異熱點

• 近年來流行的 PRV 變異株（如 China PRV 2012-like 株）在 gB 的 DⅢ 區(qū)存在多個氨基酸替換（如 aa 1050-1060 位的 N→D 突變），導致傳統(tǒng)疫苗誘導的中和抗體結合效率下降約 30%。
• 糖基化位點變異：野毒株 gB 新增 N450 糖基化位點，可能通過糖鏈遮蔽抗原表位，介導免疫逃逸。

2. 應對策略

• 廣譜 gB 抗原設計：分析不同變異株 gB 的保守表位（如 DⅠ 區(qū) aa 50-70），設計多表位串聯(lián)重組蛋白；
• 結構疫苗學：基于 gB 三聚體冷凍電鏡結構（分辨率 2.8 Å），靶向融合肽等保守區(qū)域設計小分子抑制劑或疫苗。

1. 單顆粒冷凍電鏡（Cryo-EM）：解析 gB 三聚體與宿主受體（nectin-1）的復合物結構，揭示膜融合機制；
2. 酵母表面展示技術：篩選針對變異株 gB 表位的高親和力納米抗體，用于診斷或中和治療；
3. 反向遺傳學：構建 gB 定點突變株（如破壞融合肽），開發(fā)復制缺陷型活疫苗。