犬紅細胞單克隆抗體基礎特性、制備流程與應用領域

瀏覽次數(shù)：62　發(fā)布日期：2025-7-1　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責任自負

犬紅細胞單克隆抗體（Canine Red Blood Cell Monoclonal Antibody，cRBC-McAb）是針對犬紅細胞（canine Red Blood Cell，cRBC）表面特異性抗原制備的單克隆抗體，憑借其特異性強、均一性高等特點，在犬類疾病診斷、免疫學研究及獸醫(yī)臨床中具有重要應用價值。以下從基礎特性、制備流程、應用領域等方面詳細介紹：

一、犬紅細胞（cRBC）與 cRBC-McAb 的基礎特性

犬紅細胞的抗原特征：犬紅細胞表面存在多種獨特抗原，包括血型抗原（如犬常見的 DEA 1.1、DEA 1.2、DEA 3、DEA 4 等血型系統(tǒng)抗原）、膜蛋白抗原（如帶 3 蛋白、血型糖蛋白）及糖脂類抗原等。其中，血型抗原是引發(fā)犬輸血反應的關(guān)鍵因素（如 DEA 1.1 陽性血輸給陰性犬可能導致溶血），也是 cRBC-McAb 的重要靶向?qū)ο蟆?/span>
cRBC-McAb 的核心特性：由單一 B 淋巴細胞克隆分泌，僅識別 cRBC 表面的特定抗原表位，具有特異性強（可精準區(qū)分不同血型或抗原亞型）、批次穩(wěn)定性高（克服多克隆抗體成分復雜、差異大的問題）、可規(guī)�；苽�等優(yōu)勢，為犬紅細胞相關(guān)研究和應用提供了標準化工具。

二、cRBC-McAb 的制備流程

免疫原制備與動物免疫：
- 免疫原：采集健康犬的新鮮抗凝血，通過生理鹽水或 PBS 反復洗滌（去除血漿蛋白、白細胞等雜質(zhì)），獲得純化的犬紅細胞懸液（濃度通常為 1-5%）。
- 免疫動物：常用 Balb/c 小鼠，通過腹腔或靜脈注射進行免疫。為增強免疫應答，可采用 “初次免疫 + 多次加強免疫” 策略（間隔 1-2 周），最后一次免疫后 3-5 天取脾臟細胞，用于后續(xù)細胞融合。
細胞融合與雜交瘤篩選：
- 融合步驟：將免疫小鼠的脾臟 B 淋巴細胞與骨髓瘤細胞（如 SP2/0）通過聚乙二醇（PEG）或電融合技術(shù)融合，形成雜交瘤細胞。
- 篩選培養(yǎng)：利用 HAT 選擇培養(yǎng)基（含次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶）篩選存活的雜交瘤細胞（未融合的骨髓瘤細胞和 B 淋巴細胞因代謝缺陷無法存活）。
陽性克隆鑒定與克隆化：
- 鑒定方法：通過間接血凝試驗（IHA）檢測雜交瘤細胞上清液與 cRBC 的特異性結(jié)合（若產(chǎn)生凝集反應則為陽性）；或采用流式細胞術(shù)（FCM）更精準地驗證抗體與 cRBC 表面抗原的結(jié)合能力（標記熒光二抗后檢測熒光信號）。
- 克隆化培養(yǎng)：對陽性雜交瘤細胞通過有限稀釋法或單細胞克隆技術(shù)進行多次克隆，確保獲得能穩(wěn)定分泌目標抗體的單克隆細胞株。
抗體生產(chǎn)與純化：
- 小規(guī)模生產(chǎn)：將雜交瘤細胞腹腔注射到 Balb/c 小鼠（預先注射降植烷），收集腹水，經(jīng)離心、飽和硫酸銨鹽析或蛋白 A/G 親和層析純化，獲得高純度抗體。
- 大規(guī)模生產(chǎn)：利用生物反應器體外培養(yǎng)雜交瘤細胞，從培養(yǎng)液中純化抗體，適用于工業(yè)化試劑盒生產(chǎn)。

三、主要應用領域

犬血型鑒定與輸血安全：
- 犬血型系統(tǒng)復雜（已發(fā)現(xiàn) 13 種血型抗原，以 DEA 1.1 最為重要），輸血前需匹配血型，否則可能引發(fā)溶血性輸血反應。cRBC-McAb（如抗 DEA 1.1 單克隆抗體）可通過凝集試驗快速鑒定犬血型（如 DEA 1.1 陽性 / 陰性），確保輸血安全。
- 應用示例：將待檢犬紅細胞與抗 DEA 1.1 McAb 反應，若出現(xiàn)凝集，說明該犬為 DEA 1.1 陽性，需選擇同型血源。
犬免疫介導性溶血性貧血（IMHA）的診斷：
- IMHA 是犬常見的自身免疫性疾病，患病犬體內(nèi)產(chǎn)生抗自身紅細胞的抗體（自身抗體），導致紅細胞破壞。cRBC-McAb 可作為特異性試劑，通過直接抗球蛋白試驗（DAT，即 Coomb’s 試驗）檢測紅細胞表面吸附的自身抗體：將 cRBC-McAb 與待檢紅細胞孵育，若出現(xiàn)凝集，提示存在自身抗體，輔助確診 IMHA。
獸醫(yī)免疫學研究：
- 作為工具抗體研究犬紅細胞的抗原結(jié)構(gòu)（如血型抗原的分子機制）、犬免疫系統(tǒng)對紅細胞的識別與應答規(guī)律。
- 用于建立犬紅細胞相關(guān)的免疫模型（如模擬輸血反應的動物模型），評估免疫抑制劑的療效。
生物實驗與診斷試劑盒開發(fā)：
- 在犬血液學實驗中，可通過 cRBC-McAb 特異性標記犬紅細胞，用于流式細胞術(shù)分析紅細胞的數(shù)量、活性或形態(tài)變化。
- 作為核心試劑開發(fā)標準化診斷試劑盒（如犬血型檢測試劑盒、IMHA 診斷試劑盒），提高檢測的準確性和重復性。

四、優(yōu)勢與注意事項

核心優(yōu)勢：
- 特異性精準：可針對單一血型抗原（如 DEA 1.1）或特定膜蛋白，避免與其他物種紅細胞（如人、貓紅細胞）的交叉反應（需驗證）。
- 標準化程度高：批次間差異小，適合臨床診斷的規(guī)范化應用。
注意事項：
- 抗原表位的特異性：不同 cRBC-McAb 可能識別不同抗原（如 DEA 1.1 vs DEA 4），需根據(jù)應用場景選擇匹配抗體（如血型鑒定需對應目標血型抗原）。
- 保存與活性維持：純化后的抗體需在 - 20℃凍存，避免反復凍融；使用前需驗證活性（如通過凝集試驗確認）。