犬胰脂肪酶單克隆抗體的制備與應(yīng)用

一、犬胰脂肪酶（cPL）概述

犬胰脂肪酶（Canine Pancreatic Lipase, cPL）是由胰腺腺泡細(xì)胞分泌的絲氨酸水解酶，主要功能是催化膳食脂肪分解為脂肪酸和甘油。其在血清中的濃度升高是犬急性胰腺炎（AP）的重要診斷指標(biāo)。制備高特異性 cPL 單克隆抗體，對(duì)開發(fā)胰腺炎快速檢測(cè)試劑盒（如 cPL-I 測(cè)試板）、研究胰腺病理機(jī)制具有關(guān)鍵意義。

 

二、cPL 單克隆抗體制備流程

（一）抗原制備與優(yōu)化

cPL 蛋白獲取

 

天然提�。簭娜�胰腺組織中通過勻漿、離心獲取粗酶液，經(jīng)疏水層析（如苯基瓊脂糖）和親和層析（如肝素瓊脂糖）純化天然 cPL，但天然蛋白易受蛋白酶降解，純度通常＜90%。

重組表達(dá)： 

克隆犬 cPL 基因（含信號(hào)肽和催化結(jié)構(gòu)域），構(gòu)建至畢赤酵母（P. pastoris）表達(dá)系統(tǒng)（真核表達(dá)可保證糖基化修飾）；

甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，通過鎳柱親和層析（His 標(biāo)簽標(biāo)記）或離子交換層析純化，SDS-PAGE 驗(yàn)證分子量（約 50 kDa），并測(cè)定酶活性（≥1000 U/mg）以確認(rèn)功能活性。

抗原佐劑結(jié)合

 

若重組 cPL 免疫原性不足（如小片段多肽），可與載體蛋白（KLH）偶聯(lián)，并用弗氏完全佐劑乳化（初次免疫），增強(qiáng) B 細(xì)胞活化信號(hào)。

（二）動(dòng)物免疫與效價(jià)檢測(cè)

免疫方案

 

對(duì)象：6-8 周齡 Balb/c 小鼠（3-5 只），免疫前檢測(cè)血清背景（避免抗胰腺蛋白天然抗體干擾）。

程序：

① 初次免疫：皮下注射重組 cPL（50-100 μg / 只）+ 弗氏完全佐劑；

② 加強(qiáng)免疫：每 2 周腹腔注射一次，共 3 次，使用弗氏不完全佐劑；

③ 末次免疫：融合前 3 天，靜脈注射無佐劑 cPL（50 μg / 只），刺激脾細(xì)胞增殖。

效價(jià)監(jiān)測(cè)

 

末次免疫后 7 天，采集小鼠血清，以 cPL 包被 ELISA 板（1 μg/mL），檢測(cè)抗體效價(jià)，選擇效價(jià)≥1:20,000 的小鼠進(jìn)行脾細(xì)胞提取。

（三）雜交瘤細(xì)胞構(gòu)建與篩選

細(xì)胞融合

 

取免疫小鼠脾臟制備單細(xì)胞懸液（1×10⁸個(gè)），與 SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞按 5:1 比例混合，用 50% PEG 1500 在 37℃下誘導(dǎo)融合，隨后接種于 HAT 培養(yǎng)基（含次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶）。

克隆篩選與鑒定

 

初篩（ELISA）：以 cPL 包被 96 孔板，篩選上清 OD 值≥陰性對(duì)照 2.1 倍的孔；

復(fù)篩（Western blot）：對(duì)初篩陽性孔培養(yǎng)上清進(jìn)行 WB 檢測(cè)，確認(rèn)抗體與天然 cPL（犬胰腺組織裂解液）的結(jié)合特異性；

克隆化：采用有限稀釋法（0.5 個(gè)細(xì)胞 / 孔）進(jìn)行 3 次單克隆化，獲得穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞株。

（四）抗體生產(chǎn)與純化

腹水制備

 

給 Balb/c 小鼠腹腔注射石蠟油（0.5 mL / 只）預(yù)處理，7 天后接種雜交瘤細(xì)胞（1×10⁶個(gè) / 只），7-10 天后收集腹水，4℃離心（3000 rpm，10 min），上清過濾除雜。

純化工藝

 

親和層析：腹水經(jīng) Protein G 柱純化（針對(duì) IgG 類抗體），洗脫液用 PBS 透析脫鹽，超濾濃縮至 1-2 mg/mL；

純度驗(yàn)證：SDS-PAGE 檢測(cè)顯示單一蛋白條帶（IgG 重鏈≈50 kDa，輕鏈≈25 kDa），純度≥95%。

（五）抗體功能鑒定

特異性驗(yàn)證

 

交叉反應(yīng)檢測(cè)：ELISA 法檢測(cè)抗體與犬血清其他脂肪酶（如肝脂肪酶、腸脂肪酶）的結(jié)合率，要求交叉反應(yīng)＜1%；

組織定位：免疫組化染色犬胰腺組織，確認(rèn)抗體特異性識(shí)別胰腺腺泡細(xì)胞中的 cPL。

親和力與效價(jià)測(cè)定

 

親和力：SPR 技術(shù)測(cè)定 KD 值，高親和力抗體 KD≤10⁻⁹ M；

效價(jià)：腹水抗體 ELISA 效價(jià)應(yīng)≥1:10⁵，適用于夾心 ELISA 或膠體金檢測(cè)。

三、關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)與解決方案

 

難點(diǎn)解決方案

cPL 天然蛋白純化困難 采用重組表達(dá)系統(tǒng)（如畢赤酵母），添加蛋白酶抑制劑（PMSF）防止降解

抗體與其他脂肪酶交叉反應(yīng) 篩選時(shí)增加競(jìng)爭 ELISA 步驟（用肝 / 腸脂肪酶吸附抗體），或選擇 cPL 特有序列（如活性中心附近肽段）作為抗原

酶活性表位干擾 免疫前分析 cPL 三維結(jié)構(gòu)，避免抗原覆蓋催化結(jié)構(gòu)域（如 Ser152、His263、Asp284 位點(diǎn)），確�？贵w不抑制酶活性

四、應(yīng)用場(chǎng)景

臨床診斷

 

胰腺炎快速檢測(cè)：制備膠體金免疫層析試紙條（如 cPL 檢測(cè)板），通過檢測(cè)血清 cPL 濃度（臨界值＞5.4 μg/L）診斷急性胰腺炎，符合國際獸醫(yī)臨床標(biāo)準(zhǔn)（ACVIM 指南）；

ELISA 試劑盒開發(fā)：用于定量分析 cPL 水平，輔助監(jiān)測(cè)胰腺炎治療效果。

基礎(chǔ)研究

 

免疫熒光：定位 cPL 在胰腺組織中的表達(dá)分布，研究胰腺炎時(shí) cPL 的細(xì)胞外釋放機(jī)制；

IP-MS：通過抗體沉淀 cPL 及其結(jié)合蛋白，篩選胰腺炎相關(guān)信號(hào)通路（如 MAPK、NF-κB 通路）的調(diào)控因子。

藥物研發(fā)

 

抑制劑篩選：作為工具抗體檢測(cè) cPL 活性，篩選特異性抑制 cPL 的小分子藥物（用于治療胰腺自身消化）；

抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）：實(shí)驗(yàn)性研究靶向胰腺炎癥部位的藥物遞送系統(tǒng)（需進(jìn)一步驗(yàn)證安全性）。

五、注意事項(xiàng)

抗原活性：重組 cPL 需保持天然構(gòu)象（如正確折疊的催化三聯(lián)體），否則可能影響抗體識(shí)別功能性表位；

檢測(cè)體系優(yōu)化：臨床診斷用抗體需匹配檢測(cè)平臺(tái)（如膠體金法要求抗體親和力高、反應(yīng)速度快）；

保存與質(zhì)控：抗體分裝后 - 20℃保存，使用前需驗(yàn)證批次間穩(wěn)定性（效價(jià)波動(dòng)≤10%）；

倫理與合規(guī)：若用于體外診斷試劑（IVD），需符合 FDA、NMPA 等監(jiān)管機(jī)構(gòu)的注冊(cè)要求（如特異性、靈敏度驗(yàn)證）。

通過上述流程制備的犬胰脂肪酶單克隆抗體，可滿足從臨床快速診斷到機(jī)制研究的多維度需求，其核心在于抗原設(shè)計(jì)的功能保留、篩選過程的嚴(yán)格特異性驗(yàn)證，以及應(yīng)用場(chǎng)景的針對(duì)性優(yōu)化。