抗狂犬病毒( RV)的抗原特性、單抗制備、特異性優(yōu)化及應(yīng)用場(chǎng)景
瀏覽次數(shù):131 發(fā)布日期:2025-6-29
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抗狂犬病毒(Rabies Virus, RV)N 蛋白和 G 蛋白的單克隆抗體(Monoclonal Antibodies, mAbs)在病毒檢測(cè)、疫苗評(píng)價(jià)及基礎(chǔ)研究中具有重要價(jià)值。以下從抗原特性、單抗制備、特異性優(yōu)化及應(yīng)用場(chǎng)景四個(gè)維度展開(kāi)闡述:
一、RV N 蛋白與 G 蛋白的抗原特性
1.
N 蛋白(核衣殼蛋白)
- 結(jié)構(gòu)與功能:
N 蛋白是 RV 最保守的結(jié)構(gòu)蛋白,包裹病毒 RNA 形成核衣殼,免疫原性極強(qiáng),可誘導(dǎo)高效 IgG 抗體產(chǎn)生,但無(wú)中和活性。
- 抗原表位特點(diǎn):
含多個(gè)線性表位,對(duì)病毒株變異不敏感,是診斷檢測(cè)的理想靶點(diǎn)(如區(qū)分街毒株與疫苗株)。
2.
G 蛋白(糖蛋白)
- 結(jié)構(gòu)與功能:
G 蛋白是 RV 表面唯一的糖蛋白,以三聚體形式介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞受體(如乙酰膽堿受體、nectin-1)結(jié)合及膜融合,是唯一能誘導(dǎo)中和抗體的抗原。
- 抗原表位特點(diǎn):
含 5 個(gè)抗原位點(diǎn)(I-V),其中位點(diǎn) II 和 IV 為中和表位,易受病毒變異影響(如蝙蝠株 G 蛋白突變可能降低抗體結(jié)合效率)。
二、抗 RV N/G 蛋白單克隆抗體的制備技術(shù)
1.
傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)制備流程
(1)抗原制備
- N 蛋白:通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)(如 E. coli)表達(dá)重組 N 蛋白(rN 蛋白),或使用滅活 RV 病毒顆粒(如 CVS 株)。
- G 蛋白:采用桿狀病毒 - 昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)重組 G 蛋白(rG 蛋白),保留天然構(gòu)象(含糖基化修飾),或使用病毒樣顆粒(VLPs)提升免疫原性。
(2)動(dòng)物免疫與細(xì)胞融合
- 免疫方案:
以 BALB/c 小鼠為宿主,腹腔注射抗原(rN/rG 蛋白 + 弗氏佐劑),共免疫 3-4 次,末次免疫后 3 天取脾臟 B 細(xì)胞與 SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞融合。
- 篩選策略:
- N 蛋白單抗:通過(guò)間接 ELISA 篩選與 rN 蛋白結(jié)合強(qiáng)、與其他病毒(如犬瘟熱病毒)無(wú)交叉反應(yīng)的克隆。
- G 蛋白單抗:采用中和試驗(yàn)(VNT)篩選能抑制 RV 感染 BHK-21 細(xì)胞的中和性單抗(結(jié)合位點(diǎn) II/IV)。
(3)單克隆抗體純化與鑒定
- 采用 Protein A/G 親和層析純化腹水或細(xì)胞培養(yǎng)上清中的 IgG,通過(guò) Western blot、ELISA 及中和試驗(yàn)驗(yàn)證特異性與功能。
2.
基因工程單克隆抗體制備
- 噬菌體展示技術(shù):
構(gòu)建小鼠或人源抗體可變區(qū)(VH-VL)文庫(kù),以 rN/rG 蛋白為靶點(diǎn)進(jìn)行生物淘選,獲得重組單鏈抗體(scFv)或 Fab 片段,可在大腸桿菌中規(guī);a(chǎn)。
- 人源化單克隆抗體:
通過(guò) CDR 移植技術(shù)將鼠源單抗的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)嫁接到人源 IgG 框架上,降低免疫原性,適用于治療性抗體開(kāi)發(fā)(如狂犬病被動(dòng)免疫制劑)。
三、單克隆抗體的特異性優(yōu)化策略
1.
針對(duì) N 蛋白單抗的交叉反應(yīng)控制
- 吸附去除法:
將抗 N 蛋白單抗與犬副流感病毒、犬腺病毒等犬科動(dòng)物病毒抗原共孵育,通過(guò)親和吸附去除非特異性抗體。
- 表位 mapping 篩選:
合成 N 蛋白的多肽片段(如氨基酸殘基 100-200),篩選僅識(shí)別 RV N 蛋白特有表位的單抗(如與 rabies-related lyssaviruses 無(wú)交叉反應(yīng))。
2.
針對(duì) G 蛋白單抗的中和表位強(qiáng)化
- 抗原構(gòu)象優(yōu)化:
使用天然 G 蛋白(如病毒包膜純化的 G 蛋白)或 VLPs 免疫,誘導(dǎo)識(shí)別構(gòu)象表位的中和性單抗,避免重組 G 蛋白線性表位的免疫偏差。
- 逃逸突變株篩選:
通過(guò) RV 與單抗共培養(yǎng)篩選逃逸突變株,反向驗(yàn)證單抗的中和表位穩(wěn)定性(如突變位點(diǎn)位于 G 蛋白受體結(jié)合域則提示表位易變異)。
四、單克隆抗體的應(yīng)用場(chǎng)景
1.
病毒檢測(cè)與診斷
(1)N 蛋白單抗的應(yīng)用
- 免疫熒光(IFA):標(biāo)記 FITC 或 Alexa Fluor 的抗 N 蛋白單抗,用于腦組織印片或細(xì)胞培養(yǎng)物中 RV 的快速檢測(cè)(金標(biāo)準(zhǔn)方法)。
- ELISA 檢測(cè)試劑盒:
雙抗體夾心法(包被抗 N 單抗 + 生物素化抗 N 單抗),檢測(cè)血清 / 腦脊液中的 RV 抗原,靈敏度達(dá) 0.1 ng/mL。
- 膠體金試紙條:
用于動(dòng)物唾液、腦組織懸液中 RV 抗原的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)(15 分鐘內(nèi)出結(jié)果),適合狂犬病疫區(qū)野外篩查。
(2)G 蛋白單抗的應(yīng)用
- 中和試驗(yàn)(VNT):
基于抗 G 蛋白中和性單抗的病毒中和試驗(yàn)(如快速熒光灶抑制試驗(yàn),RFFIT),用于評(píng)估疫苗誘導(dǎo)的中和抗體滴度(WHO 推薦疫苗效力檢測(cè)方法)。
- 病毒分型與進(jìn)化分析:
通過(guò)不同 G 蛋白單抗的結(jié)合譜,區(qū)分 RV 不同基因型(如基因 1 型至基因 7 型),輔助流行病學(xué)調(diào)查。
2.
疫苗研發(fā)與質(zhì)量控制
- 疫苗效力評(píng)價(jià):
抗 G 蛋白中和性單抗可用于檢測(cè)疫苗免疫后動(dòng)物血清的中和活性,替代傳統(tǒng)的動(dòng)物攻毒試驗(yàn)。
- 疫苗抗原純化:
抗 N 蛋白單抗偶聯(lián)至親和層析柱,用于 RV 疫苗株(如 Vero 細(xì)胞培養(yǎng)的 Flury 株)的抗原純化,提升疫苗純度。
3.
治療性抗體開(kāi)發(fā)
- 狂犬病被動(dòng)免疫:
人源化抗 G 蛋白中和性單抗(如 RB001)可替代馬源免疫血清或人狂犬病免疫球蛋白(HRIG),用于暴露后緊急預(yù)防,降低過(guò)敏風(fēng)險(xiǎn)。
- 中和機(jī)制研究:
抗 G 蛋白單抗可阻斷病毒與宿主受體結(jié)合(如競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)),為抗病毒藥物設(shè)計(jì)提供靶點(diǎn)參考。
五、技術(shù)挑戰(zhàn)與前沿方向
- 病毒變異的應(yīng)對(duì):
蝙蝠源 RV 毒株的 G 蛋白存在高頻突變(如抗原位點(diǎn) IV 的氨基酸替換),需開(kāi)發(fā)針對(duì)跨基因型保守表位的廣譜中和性單抗。
- 檢測(cè)技術(shù)的升級(jí):
結(jié)合微流控芯片技術(shù),將抗 N/G 蛋白單抗集成于便攜式檢測(cè)平臺(tái),實(shí)現(xiàn)唾液樣本中 RV 抗原的超敏檢測(cè)(檢測(cè)限達(dá) 10² TCID₅₀/mL)。
- 雙特異性抗體應(yīng)用:
設(shè)計(jì)同時(shí)靶向 N 蛋白(診斷)和 G 蛋白(中和)的雙特異性抗體,用于狂犬病的即時(shí)診斷 - 治療一體化策略。
總結(jié)
抗 RV N/G 蛋白單克隆抗體在狂犬病的診斷、預(yù)防及研究中扮演關(guān)鍵角色。N 蛋白單抗憑借高保守性成為檢測(cè)核心工具,而 G 蛋白單抗則通過(guò)中和活性推動(dòng)治療性抗體與疫苗評(píng)價(jià)技術(shù)的發(fā)展。未來(lái)需結(jié)合基因工程技術(shù)與病毒進(jìn)化研究,持續(xù)優(yōu)化抗體的特異性與功能,為全球狂犬病防控提供更高效的分子工具。