鐵死亡檢測(cè)方法指南：關(guān)鍵標(biāo)志物分析與染色方法

檢測(cè)鐵死亡的方法包括：檢測(cè)代謝反應(yīng)（如脂代謝、鐵代謝和 GSH 相關(guān)代謝）相關(guān)標(biāo)志物含量變化、細(xì)胞形態(tài)變化、和分子蛋白含量/活性變化。

01
脂代謝相關(guān)生物標(biāo)志物檢測(cè)

過(guò)度的脂質(zhì)過(guò)氧化通過(guò)產(chǎn)生有毒的磷脂氫過(guò)氧化物（PLOOH），在促進(jìn)鐵死亡中起著重要作用。因此，脂質(zhì)過(guò)氧化相關(guān)的生物標(biāo)志物是鐵死亡的關(guān)鍵檢測(cè)指標(biāo)。

1.1 脂質(zhì)過(guò)氧化物檢測(cè)

BODIPY 581/591 C11 是一種脂溶性比率型熒光探針，能夠嵌入細(xì)胞膜并與細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)相互作用。在未氧化狀態(tài)下，呈現(xiàn)紅色熒光 (還原型；Ex=581 nm, Em=591 nm)。

當(dāng)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡時(shí)，亞鐵離子 (Fe2+) 和 ROS 促進(jìn)脂質(zhì)氧化，形成脂質(zhì)過(guò)氧化物，BODIPY 581/591 C11 被氧化，發(fā)射波長(zhǎng)從 591 nm 轉(zhuǎn)移到 510 nm，產(chǎn)生綠色熒光 (氧化型；Ex=500 nm, Em=510 nm)。

需要注意的是，BODIPY 581/591 C11 對(duì)脂溶性膜內(nèi)各種活性氧 (ROS) 和過(guò)氧亞硝酸鹽 (ONOO-) 也較為敏感，因此它也可以用于鐵死亡細(xì)胞中 ROS 和 RNS 的檢測(cè)。

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Cat. No.	Product Name	Application
HY-D1301	BODIPY 581/591 C11	比率型熒光探針； 健康細(xì)胞：紅色熒光 (Ex/Em=581/591 nm)；  鐵死亡細(xì)胞：綠色熒光 (Ex/Em=500/510 nm)
HY-D1412	LPd peroxida probe	健康細(xì)胞：微弱的綠色熒光； 鐵死亡細(xì)胞：更為明亮的綠色熒光 (Ex/Em=524/535 nm)
HY-125623	MitoPerOx	檢測(cè)線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化； 健康細(xì)胞：微弱的綠色熒光； 鐵死亡細(xì)胞：更為明亮的綠色熒光 (Ex/Em=485/520 nm)

 
BODIPY 581/591 C11 染色參考

1. 儲(chǔ)備液及工作液的制備:
 (1) 用 DMSO 配制 10 mM BODIPY 581/591 C11 儲(chǔ)備液（-20°C 或 -80°C 避光保存，避免反復(fù)凍融）。
 (2) 染色前用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基或 PBS 稀釋儲(chǔ)備液，制備 2-10 μM BODIPY 581/591 C11 工作液（請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整工作液濃度）。

2. 細(xì)胞染色：
(1) 細(xì)胞制備
懸浮細(xì)胞：4°C, 1000 ×g 離心 3-5 分鐘，棄上清。PBS 洗 2 次，每次 5 分鐘。
貼壁細(xì)胞：棄去培養(yǎng)基，加入胰蛋白酶解離細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。4°C, 1000 ×g 離心 3-5 分鐘，棄上清。
PBS 洗 2 次，每次 5 分鐘。
 (2) 加入 1 mL BODIPY 581/591 C11 工作液，室溫孵育 30 分鐘。
 (3) 4°C, 400 ×g 離心 3-4 分鐘，棄上清。PBS 洗 2 次，每次 5 分鐘。
 (4) 用 1 mL 無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基或 PBS 重懸細(xì)胞，熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2 活性氧的檢測(cè)[20]

活性氧（ROS） 在鐵死亡過(guò)程中不僅促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞損傷，還抑制抗氧化信號(hào)通路，是鐵死亡檢測(cè)的重要生物標(biāo)志物。H2DCFDA（DCFH-DA）是一種可滲透細(xì)胞的活性氧探針。進(jìn)入細(xì)胞后，H2DCFDA 在細(xì)胞內(nèi)脫酯化，并被 ROS 氧化成具有強(qiáng)烈熒光的 DCF，產(chǎn)生綠色熒光（Ex: 488 nm, Em: 525 nm）。通過(guò)熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或分光光度計(jì)等設(shè)備可以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) ROS 水平。
 
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H2DCFDA 染色方法參考

1. 儲(chǔ)備液及工作液的制備 :
 (1) 用DMSO配制5mM的H2DCFDA儲(chǔ)備液（-20°C或 -80°C避光保存，避免反復(fù)凍融）。
 (2) 染色前用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基或PBS稀釋儲(chǔ)備液，配制成1-10μM的H2DCFDA工作液。（請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整工作液濃度）。

2. 細(xì)胞染色：
 (1) 懸浮細(xì)胞
· 離心收集細(xì)胞，保持密度約為1×106個(gè)。PBS洗滌兩次，每次5分鐘。
· 加入1mL 染料工作液，室溫孵育5-30分鐘。
· 400×g離心3-4分鐘，棄上清。PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次5分鐘。
· 用1mL無(wú)血清培養(yǎng)基或PBS重懸細(xì)胞，使用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行觀察。
 (2) 貼壁細(xì)胞
· 將貼壁細(xì)胞培養(yǎng)于無(wú)菌蓋玻片上。
· 從培養(yǎng)基中移出蓋玻片，置于載玻片上，吸除多余培養(yǎng)基。加入 100 μL 染料工作液， 輕輕晃動(dòng)使其完全覆蓋細(xì)胞，孵育 5-30 分鐘。
· 吸去染料工作液，培養(yǎng)基洗 2-3 次，每次 5 分鐘，使用熒光顯微鏡觀察。
注：若需要用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，需將細(xì)胞用胰蛋白酶消化并重懸后再進(jìn)行染色。
 
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Cat. No.	Product Name	Application
HY-D0940	H2DCFDA	健康細(xì)胞: 微弱的綠色熒光 鐵死亡細(xì)胞: 更為明亮的綠色熒光 (Ex/Em=488/525 nm)
HY-K0320	ROS Assay Kit	原理同 H2DCFDA; 提供陽(yáng)性對(duì)照試劑 (Rosup)
HY-D0079	Dihydroethidium (DHE)	健康細(xì)胞: 藍(lán)色熒光 (Ex/Em=370/420 nm); 鐵死亡細(xì)胞: 紅色熒光 (Ex/Em=535/610 nm)

 
1.3 過(guò)氧化脂質(zhì)衍生物的檢測(cè)[21][22]

脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)過(guò)程中，大量的脂質(zhì)過(guò)氧化初級(jí)產(chǎn)物在氧化反應(yīng)中逐漸分解為一系列復(fù)雜的醛類化合物，包括 MDA，4-HNE，丙醛和己醛等。這些活性醛類物質(zhì)能夠攻擊蛋白質(zhì)等生物大分子，形成加合物，從而引發(fā)細(xì)胞的進(jìn)一步損傷。

Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit 是一種基于硫代巴比妥酸 (TBA) 反應(yīng)物法的試劑盒，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物 MDA 與 TBA 在高溫和酸性條件下反應(yīng)，形成一種具有特定顏色的 MDA-TBA 復(fù)合物，其最大吸收波長(zhǎng)通常在 532 nm 處，可通過(guò)比色法來(lái)定量檢測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化水平。

此外，4-HNE 抗體可以用來(lái)定量檢測(cè) 4-HNE 水平。需要注意的是，MDA 和 4-HNE 在除鐵死亡外的多種氧化應(yīng)激狀態(tài)下均可產(chǎn)生，在實(shí)際應(yīng)用中，一般與其他檢測(cè)方法進(jìn)行相互驗(yàn)證，以提高結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性[10]。

 
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Cat. No.	Product Name	Biomarker detection	Application
HY-77962	2-Thiobarbituric acid (TBA)	MDA	TBA 與 MDA 形成絡(luò)合物，可通過(guò)比色法測(cè)定 (OD=532 nm)
HY-K0319	Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit	MDA	試劑盒中 TBA 與 MDA 反應(yīng)生成 MDA-TBA 復(fù)合物，可通過(guò)比色法(OD=532 nm) 或熒光法(Ex/Em=532/553 nm)進(jìn)行定量檢測(cè)； 內(nèi)含 MDA 標(biāo)準(zhǔn)品； 可用于血漿、血清、尿液、組織及細(xì)胞中MDA含量檢測(cè)
HY-P81208	4 Hydroxynonenal (4-HNE) 抗體	4-HNE	兔來(lái)源、抗 4-HNE 多克隆抗體； 可用于 WB，ELISA，IHC-P，IF 實(shí)驗(yàn)

 
02
鐵代謝相關(guān)生物標(biāo)志物檢測(cè)[23]

在鐵死亡過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi) Fe2+的積累會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激的增加，從而促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化。因此，細(xì)胞鐵含量或者 Fe2+/Fe3+ 比值的測(cè)定可作為鐵死亡監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)。FerroOrange 是一種特異性 Fe2+ 探針，可與 Fe2+ 結(jié)合形成橙紅色熒光復(fù)合物。通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) （Ex/Em: 542/572 nm），可以實(shí)現(xiàn)定量分析細(xì)胞內(nèi) Fe2+ 的濃度。
 
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Cat. No.	Product Name	Application
HY-D1913	FerroOrange	Fe2+ 探針； 橙色熒光 (Ex/Em: 542/572 nm)
HY-D2295	Mito-FerroGreen	線粒體特異性 Fe2+ 探針； 綠色熒光 (Ex/Em: 488/535 nm)
HY-D1533	RhoNox-1	Fe2+ 探針； 橙 (紅色) 熒光 (Ex/Em: 540/575 nm)

 
03
谷胱甘肽代謝相關(guān)生物標(biāo)志物檢測(cè)

谷胱甘肽（GSH）是細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化。在鐵死亡過(guò)程中，GSH 水平顯著下降，可導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化能力減弱，進(jìn)而促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化物的積累。因此，檢測(cè) GSH 相關(guān)代謝等指標(biāo)可用于監(jiān)測(cè)鐵死亡的過(guò)程。

3.1 GSH 含量檢測(cè)[24]

比色法，熒光探針?lè)ǎ珽LISA，HPLC 和質(zhì)譜等方法都可以用來(lái)檢測(cè) GSH 含量。例如，GSH/GSSG Assay Kit是一種基于二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）法的 GSH 含量檢測(cè)試劑盒，DTNB 能夠與還原型 GSH 發(fā)生特異性反應(yīng)形成一種黃色的化合物⸺硫代二硝基苯酮（TNB），同時(shí)釋放出氧化型 GSH（GSSG）。生成的 TNB 在 405 nm 波長(zhǎng)下具有強(qiáng)吸收，可以通過(guò)比色法測(cè)定。

此外，Monochlorobimane 等 GSH 熒光探針也可用來(lái)檢測(cè) GSH 含量變化。
 
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Cat. No.	Product Name	Application
HY-K0311	GSH/GSSG Assay Kit	適用于全血、血漿、血清、尿液以及組織和細(xì)胞提取物樣本； 比色法檢測(cè) GSH/GSSG 比值 (OD: 405 nm)
HY-108715	Real Thiol	GSH 熒光探針 (Ex/Em: 405/487 nm 和 488/562 nm)； F405/F488 的熒光強(qiáng)度比值反應(yīng)了 GSH 濃度
HY-108715A	RT-A	Real thiol 前體活性分子，定量監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中 GSH 動(dòng)態(tài)變化； GSH 熒光探針 (Ex/Em: 405/487 nm 和 488/562 nm)； F405/F488 的熒光強(qiáng)度比值反應(yīng)了 GSH 濃度
HY-101899	Monochlorobimane	GSH 熒光探針 (Ex/Em: 380/470 nm)

  
3.2 胱氨酸攝取活性檢測(cè)[26]

System xc-以 1:1 的比例用胞內(nèi)谷氨酸來(lái)?yè)Q取胞外胱氨酸（Cys2）的輸入，隨后被還原為為半胱氨酸（Cys）。抑制System xc-的活性會(huì)抑制胱氨酸的吸收，影響 GSH 的合成，導(dǎo)致 GPX4 活性降低，促進(jìn)鐵死亡。因此，胱氨酸攝取活性可作為表征 System xc- 活性的檢測(cè)指標(biāo)，可通過(guò) Cys 探針檢測(cè)胞內(nèi) Cys 含量。

04
細(xì)胞和亞細(xì)胞水平的形態(tài)學(xué)檢測(cè)

4.1 細(xì)胞形態(tài)

鐵死亡細(xì)胞的典型形態(tài)學(xué)特征包括質(zhì)膜完整性喪失、細(xì)胞膜破裂、線粒體萎縮、線粒體外膜破裂、嵴減少或缺失和膜密度增加（Figure 9），可通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM）檢測(cè)。TEM 的主要缺點(diǎn)是：樣本制備過(guò)程繁瑣，需要進(jìn)行脫水、包埋和切片等步驟，可能導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)的改變，從而影響觀察結(jié)果。

電鏡分析方法參考[27]
1. 樣品固定：用 2% 戊二醛（0.1 M 磷酸鹽緩沖液，pH 7.4）固定細(xì)胞。
2. 脫水并包埋：2% OsO4 固定細(xì)胞切片后，用乙醇脫水，包埋在 Epok 812 中。
3. 切片染色：使用超微切片機(jī)切割后，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，以增強(qiáng)對(duì)比度。
4. 觀察記錄：將染色后的切片放入 TEM 中，觀察并記錄線粒體的形態(tài)變化。

4.2 亞細(xì)胞器變化

鐵死亡發(fā)生時(shí)，伴隨著線粒體膜通透性增加和線粒體膜電位降低，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)粘度增加和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，以及溶酶體鐵或一氧化氮（NO）的累積�？山柚�相關(guān)熒光探針，用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)[28]。
 
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Product Name	Reaction principle	Application	Ex/Em (nm)
HY-15534 JC-1	線粒體膜電位降低	健康細(xì)胞：紅色熒光 鐵死亡細(xì)胞：綠色熒光	紅色:585/590 綠色:510/52
HY-K0601 JC-1 線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒	線粒體膜電位降低	健康細(xì)胞：紅色熒光 鐵死亡細(xì)胞：綠色熒光 提供 (綠色熒光CCCP) 作為陽(yáng)性對(duì)照	紅色:585/590 綠色:510/52
HY-D0984A TMRM Perchlorate	線粒體膜電位降低	健康細(xì)胞：橙紅色熒光 鐵死亡細(xì)胞：基本無(wú)熒光	550/580
HY-D0084 3,3'-Dihexyloxacarbocyanine iodide	線粒體膜通透性增加	健康細(xì)胞：綠色熒光 鐵死亡細(xì)胞：綠色熒光減弱	482/504
HY-D1783 MitoTracker Deep Red FM	線粒體膜通透性增加	健康細(xì)胞：紅色熒光 鐵死亡細(xì)胞：紅色熒光減弱	548/573

 
05
調(diào)控鐵死亡的基因和蛋白的檢測(cè)

鐵死亡主要由鐵依賴性脂質(zhì)過(guò)氧化引起，其調(diào)控機(jī)制包括多種，主要分為：過(guò)氧化代謝部分（如鐵代謝和脂代謝途徑）和抗氧化部分（如 System xc--GSH-GPX4 途徑，AIFM2-CoQ10/GCH1-BH4/ESCRT-III 和 DHODH 途徑）。鐵死亡發(fā)生時(shí)，一些關(guān)鍵基因和蛋白表達(dá)水平會(huì)發(fā)生變化，因此，可采用 Western blot/免疫熒光/免疫組織化學(xué)/實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 等技術(shù)來(lái)表征鐵死亡的發(fā)生。
 
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Pathway	Protein	Expression	Antibody	Cat.No.
鐵代謝	TFR1	上調(diào)	Transferrin Receptor 1 Antibody	HY-P81000
鐵代謝	FTH1	下調(diào)	Ferritin Heavy Chain Antibody	HY-P80670
鐵代謝	SLC40A1	下調(diào)	SLC40A1 Antibody	HY-P81218
脂代謝	ACSL4	上調(diào)	FACL4 Antibody	HY-P80977
脂代謝	ALOX12	上調(diào)	12 Lipoxygenase Antibody (YA2038)	HY-P82293
脂代謝	ALOX15	上調(diào)	ALOX15 Antibody (YA1309)	HY-P81564

脂代謝	COX2	上調(diào)	COX2/Cyclooxygenase 2 Antibody	HY-P80091
System xc-- GSH-GPX4	SLC7A11	下調(diào)	xCT Antibody (YA006)	HY-P80935
System xc-- GSH-GPX4	SLC7A11	下調(diào)	xCT Antibody (YA652)	HY-P80523
System xc-- GSH-GPX4	GPX4	下調(diào)	GPX4 Antibody	HY-P80450
其他抗氧化 通路	Nrf2	上調(diào)	Nrf2 Antibody (YA895)	HY-P81051
其他抗氧化 通路	FSP1	下調(diào)	AMID/FSP1 Antibody	HY-P80679

 
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參考文獻(xiàn)：
[10] Biochem Biophys Res Commun. 2020 Feb 5;522(2):415-421.
[19] Chemical Engineering Journal, 2024: 152398.
[20] Small. 2021 Aug;17(32):e2101368.
[21] Biochim Biophys Acta. 2012 Oct;1818(10):2374-87.
[22] Inflammation. 2024 Jul 22.
[23] Ethnopharmacol. 2024 Oct 28;333:118465.
[24] Talanta. 2021 Mar 1;224:121852.
[25] Research Square Preprint. 2024. Feb 5.
[26] Angew Chem Int Ed Engl. 2023 Aug 28;62(35):e202300379.
[27] Biochem Biophys Res Commun. 2020 Jun 30;527(3):839-844.
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[29] Cell Death Dis. 2022 Oct 29;13(10):912.
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[31] Phytother Res. 2024 Dec;38(12):5583-5597.

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