無血清培養(yǎng)基工藝優(yōu)化步驟及申報問題解答

無血清培養(yǎng)基是指不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長和增殖的人工合成培養(yǎng)基，簡單的理解就是體外細胞培養(yǎng)過程中的細胞培養(yǎng)基不含有動物血清。無血清培養(yǎng)基的基本成分可以分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。大多數(shù)的無血清培養(yǎng)基含有必須的向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運離子的轉(zhuǎn)鐵蛋白、調(diào)節(jié)葡萄糖攝取量的胰島素和微量元素（如硒），以及一些蛋白質(zhì)如纖連蛋白、層粘連蛋白、球蛋白、細胞生長因子等。無血清培養(yǎng)基目前被廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)哺乳動物和無脊動物細胞以制備單克隆抗體、病毒抗原、重組蛋白、疫苗、干細胞及免疫細胞治療等多個方面。
 

1.無血清培養(yǎng)基分類及特點

通常而言，無血清培養(yǎng)基包括了無血清培養(yǎng)基、無蛋白無血清培養(yǎng)基、無動物來源的無血清培養(yǎng)基、化學(xué)成分限定培養(yǎng)基等類型。

無血清培養(yǎng)基：是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基里補充了一些添加物，包括人激素、牛的轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白等，廣泛的應(yīng)用于多種細胞系的培養(yǎng)，比如造血細胞系的培養(yǎng)；

無蛋白無血清培養(yǎng)基：該類培養(yǎng)基完全不含有血清和動物來源的蛋白，但仍包含來源于植物蛋白的水解物或合成多肽片段等其他衍生物。由于所含蛋白極低，并且蛋白成分明確，有利于重組蛋白的下游生產(chǎn)、分離和純化，總體成本也會大幅度下降。但其通用性較差，需要針對目標細胞株進行特異性的優(yōu)化。目前主要應(yīng)用于生命科學(xué)研究和基因工程藥物開發(fā)等領(lǐng)域；

無動物來源的無血清培養(yǎng)基：是指以基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制的培養(yǎng)液無需添加牛血清，且該培養(yǎng)基成分中不含有任何動物來源成分，即可培養(yǎng)細胞和維持生長。僅采用蛋白水解物、重組蛋白或其他化學(xué)物質(zhì)來取代動物源蛋白。它既可以滿足細胞生長及增殖的需要，還能夠降低培養(yǎng)基的生產(chǎn)成本，提高重組蛋白類藥物安全性。目前主要應(yīng)用于生物藥品的研發(fā)和生產(chǎn)中。比如CHO細胞、293細胞、Vero細胞、C6細胞等；

化學(xué)成分限定培養(yǎng)基：此類培養(yǎng)基完全無血清、無蛋白，成分完全明確，可以保證培養(yǎng)基批次間的一致性。它不但有利于跟蹤細胞培養(yǎng)的代謝情況，而且在后續(xù)的分離純化中也非常方便，是目前最為安全和理想的培養(yǎng)基�？墒遣⒎撬�有的細胞都能在化學(xué)成分限定培養(yǎng)基中達到較高的表達水平，需要研究者和使用者根據(jù)具體的用途不斷改進設(shè)計方案和配方。
 

無血清培養(yǎng)基特點

2.無血清培養(yǎng)基工藝優(yōu)化

優(yōu)化步驟
無血清培養(yǎng)基優(yōu)化首先需要做好實驗設(shè)計方案及獲得信息數(shù)據(jù)的統(tǒng)計方法，這樣可以避免重復(fù)實驗浪費資源，并且可以短時間內(nèi)觀察、記錄和評估培養(yǎng)基中添加組分作用效力及組分間的相互影響。

1、篩選：基于市場反饋良好的培養(yǎng)基進行篩選，確定分析其重要組分進行初步優(yōu)化，可以考慮采用重要組分群單一成分單次驗證測試的方法進行初步優(yōu)化�；蛘呖梢钥紤]從待優(yōu)化無血清培養(yǎng)基其重要影響因素中篩選出若干個影響因子，在優(yōu)化階段使用響應(yīng)面分析法確定重要影響因子。

2、優(yōu)化：對于培養(yǎng)基開發(fā)和優(yōu)化實驗設(shè)計中已確定的重要組分進行優(yōu)化測試實驗，其中主要優(yōu)化的成分包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、補料培養(yǎng)基及添加物，可以通過響應(yīng)曲面法驗證找出體系中重要組分的優(yōu)化最佳條件。

3、驗證：對優(yōu)化的無血清培養(yǎng)基進行放大驗證，與現(xiàn)用培養(yǎng)基及商業(yè)無血清培養(yǎng)基對比測試培養(yǎng)細胞，比較培養(yǎng)的細胞生長指標與表達水平。

添加物的選擇
添加物作為培養(yǎng)基的重要組分，我們必須清楚了解添加物對每個細胞系的影響作用。以相似細胞系所需要的重要添加物作為參考，可以作為研究點開發(fā)優(yōu)化培養(yǎng)基配方。對于特定的細胞系，生長因子的需求也是變化萬千的，不過效仿同樣的方法來確定添加組分生長因子也同樣是可行的。

上皮細胞：常用的生長因子有EGF、皮質(zhì)甾類和視黃醇。細胞基質(zhì)蛋白包括纖維粘連蛋白（FN）、層粘連蛋白和膠原蛋白也是有益的，能促進細胞粘附。

間充質(zhì)細胞：生長因子包括酸性/堿性FGF（堿性比酸性更有效）、EGF（或TGFα）、IGF/胰島素（IGF更有效）、PDGF（BB型更有效）和TGFβ（TGFβ在一些情況下起作用，但是對大多數(shù)細胞來說是生長抑制因子）。其它的添加劑包括鐵轉(zhuǎn)運蛋白、皮質(zhì)甾類、細胞外基質(zhì)蛋白如纖維粘連蛋白、微量元素。

轉(zhuǎn)化細胞：通常來說，這些細胞對生長因子的要求比較低。常用的添加劑有IGF/胰島素、轉(zhuǎn)運蛋白、BSA/肽球蛋白、人轉(zhuǎn)鐵蛋白和微量元素。
 

3.無血清培養(yǎng)基申報要求

近年來，細胞與基因治療領(lǐng)域（CGT）已成為繼小分子靶向藥物、抗體藥物后最受關(guān)注的生物技術(shù)領(lǐng)域之一，也被業(yè)界當前視為生物醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)的下一個十年黃金賽道。尤其是近幾年在技術(shù)、資本和政策的驅(qū)動下，全球CGT行業(yè)快速升溫，發(fā)展態(tài)勢喜人。在國內(nèi)，CGT賽道的研發(fā)也是在如火如荼地開展著，大量CGT藥物企業(yè)也已申報進入了臨床階段。

接下來，和大家分享一些我國政府關(guān)于細胞與基因治療藥品申報文件中對于培養(yǎng)基的要求。

2015年國家衛(wèi)生計生委辦公廳、國家食品藥品監(jiān)管總局發(fā)布了《干細胞制劑質(zhì)量控制和臨床前研究指導(dǎo)原則（試行）》，規(guī)定除特殊情況外，應(yīng)盡可能避免在干細胞培養(yǎng)過程中使用人源或動物源性血清。
 

2016年中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會發(fā)布了《免疫細胞制劑制備質(zhì)量管理自律規(guī)范》亦有規(guī)定盡量避免異種血清。
 

2017年國家藥監(jiān)局發(fā)布了《細胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》，亦有規(guī)定應(yīng)盡量避免使用血清。
 

2021年國家藥監(jiān)局發(fā)布了《人源性干細胞產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則》（征求意見稿）亦有規(guī)定避免使用動物源性材料。
 

2022年5月中國藥監(jiān)局發(fā)布了《免疫細胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》亦有規(guī)定盡量避免使用動物血清、動物來源蛋白質(zhì)。

我國國家藥監(jiān)局等機構(gòu)總體來說還是禁止使用含有血清的培養(yǎng)基，推薦無血清培養(yǎng)基的應(yīng)用，如細胞的培養(yǎng)和增殖確實需要用到含有血清的培養(yǎng)基，則必須提供足夠的相關(guān)研究資料，證明使用含有血清培養(yǎng)基的必要性和安全性。

4.小結(jié)

目前，無血清培養(yǎng)基在理論研究和實踐應(yīng)用方面均已取得諸多切實有效的成果，為科學(xué)研究和國民生產(chǎn)做出了卓有成效的貢獻。但是，由于體外培養(yǎng)細胞的類型具有明顯的多樣性，而現(xiàn)有無血清培養(yǎng)基往往適用范圍較為狹窄，因此亟待需要研發(fā)出普適性強的無血清培養(yǎng)基配方，提高培養(yǎng)的通用性，以能同時滿足不同的要求。

另外，雖然無血清培養(yǎng)基較有血清培養(yǎng)基節(jié)約了血清的成本，但是有些無血清培養(yǎng)基的補充因子價格仍較為昂貴，應(yīng)進一步研發(fā)相對廉價而有效的替代品，降低總體培養(yǎng)成本。我們相信，隨著基因工程學(xué)、發(fā)酵工程學(xué)、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，無血清培養(yǎng)基的開發(fā)和優(yōu)化必將會得到更快的發(fā)展，特別是生產(chǎn)高效性、培養(yǎng)通用性、安全風(fēng)險和降低成本等方面應(yīng)成為今后無血清培養(yǎng)基深入改進的重點方向，從而使其能在生物醫(yī)藥行業(yè)和生命科學(xué)基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域得到更為廣泛而安全的應(yīng)用。