H9C2細(xì)胞培養(yǎng)中的實(shí)操技巧和常見問題解答
【產(chǎn)品介紹】
H9c2(2-1)是來(lái)源于胚胎BD1X大鼠心臟組織的原始克隆細(xì)胞系的亞克隆，具有骨骼肌的許多特性。該細(xì)胞系可用于心血管疾病的研究。該細(xì)胞表現(xiàn)出許多骨骼肌的特性，且該細(xì)胞株中的成肌細(xì)胞能融合形成多核的肌管，并對(duì)乙酰膽堿的刺激發(fā)生反應(yīng)。如果培養(yǎng)基中的血清濃度下降到1%，融合發(fā)生得很快。目前H9c2(2-1)細(xì)胞已被廣泛用于研究心臟生物學(xué)和疾病的各個(gè)方面。
H9c2(2-1)是原始克隆細(xì)胞系的亞克隆，該細(xì)胞系由Kimes .和Brandt .從胚胎BD1X大鼠心臟組織獲得，并顯示出骨骼肌的許多特性。 這個(gè)細(xì)胞株中的成肌細(xì)胞能融合形成多核的肌管，并對(duì)乙酰膽堿的刺激發(fā)生反應(yīng)。 如果培養(yǎng)基中的血清濃度下降到1%，融合發(fā)生得很快。
H9c2(2-1)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)存在少量圓形貼壁細(xì)胞，為正常的細(xì)胞增殖現(xiàn)象。細(xì)胞處于不同增殖周期，具體形態(tài)會(huì)有差異，例如分裂期細(xì)胞通常會(huì)變小變立體呈圓形甚至脫落，而分裂間期細(xì)胞會(huì)鋪展比較開，這些都是正常增殖現(xiàn)象。以下是中喬新舟拍攝的不同放大倍數(shù)的H9C2的細(xì)胞圖：
4X
10X
20X
細(xì)胞名稱：H9C2大鼠心肌細(xì)胞
細(xì)胞別名：H9c2 (2-1); H9c2; H9C2
產(chǎn)品貨號(hào)：ZQ0102
生長(zhǎng)特性：貼壁生長(zhǎng)
培養(yǎng)條件：DMEM高糖（品牌：中喬新舟 貨號(hào)：ZQ-100）+10%FBS（品牌：中喬新舟 貨號(hào)：ZQ500-A）+1%雙抗（中喬新舟 貨號(hào)：CSP006）
完全培養(yǎng)基貨號(hào)：ZM0102
培養(yǎng)環(huán)境：95%空氣，5%二氧化碳；37℃
【傳代培養(yǎng)】
該細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)：
1、細(xì)胞有脫落情況時(shí)，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌離心管中，離心（125g，3～5分鐘）1000-1200rmp收集懸浮細(xì)胞（漂浮細(xì)胞少，可能無(wú)沉淀，大部分在管壁上）；輕柔去除培養(yǎng)基，等貼壁細(xì)胞消化收集在一起混勻接種。
2、貼壁細(xì)胞用PBS洗1~2次，每次3-5ml，添加1ml 胰酶（0.25% 含EDTA）到細(xì)胞瓶中，輕輕搖勻，使胰酶溶液鋪滿細(xì)胞表面，放入培養(yǎng)箱中。1-3min后取出到顯微鏡下觀察，(若細(xì)胞無(wú)變化繼續(xù)放入培養(yǎng)箱消化)一旦細(xì)胞變圓、輕拍瓶尾部大部分細(xì)胞開始脫落，當(dāng)達(dá)到70-80%細(xì)胞漂浮脫落，立即加入5ml完全培養(yǎng)基(含10%FBS)中和。用移液管輕輕吹打6-8次，使細(xì)胞充分解離。
3、將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌離心管中，計(jì)數(shù)，離心收集細(xì)胞。用適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，使細(xì)胞密度為每毫升0.6-2X105。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶中，靜置于培養(yǎng)箱中。建議T25培養(yǎng)瓶添加5-7ml完全培養(yǎng)基，以后2-3天進(jìn)行換液。
【細(xì)胞凍存】
1、細(xì)胞密度80%以上，活細(xì)胞百分率達(dá)95%以上時(shí)，將細(xì)胞按照以上步驟進(jìn)行消化收集細(xì)胞沉淀進(jìn)行凍存。
2、細(xì)胞沉淀用適量4°C凍存液（貨號(hào)：CSP042）重懸， 建議一瓶T25細(xì)胞凍存一管（1ml/管），直接將分裝好的細(xì)胞凍存管置于-80℃超低溫冰箱中過夜，若需液氮長(zhǎng)期保存，需先置于-80℃至少一天后方可轉(zhuǎn)至液氮罐中。
NOTE:若不是我司凍存液請(qǐng)按照凍存液說明書操作，若是自配凍存液需梯度降溫凍存(2-8℃，放置 40min:-20℃,放置 30min-60min，-80℃放置一天后轉(zhuǎn)移至液氮保存)或使用程序降溫盒降溫后，再轉(zhuǎn)移至液氮中保存。
【細(xì)胞復(fù)蘇】
1、液氮取出的細(xì)胞放入干冰中轉(zhuǎn)移至細(xì)胞房，提前準(zhǔn)備好完全培養(yǎng)基，離心管等試劑和耗材。
2、凍管細(xì)胞在37°C水浴中迅速解凍（大約1-2分鐘）。為了減少污染的可能性，保持凍管瓶蓋在水浴液面之上。 一旦大部分內(nèi)容物解凍，立即將凍管移出水浴，70%的乙醇消毒凍管外壁。
3、將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到含3-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中，輕輕混勻，離心（125 g，3～5分鐘）1000-1200rmp去除培養(yǎng)基， 管底細(xì)胞沉淀用手指彈松，再添加3ml完全培養(yǎng)基至離心管內(nèi)混勻細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)。
4、用適量完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至0.6-2.0X105，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，再將瓶轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。T25培養(yǎng)瓶建議添加5-7ml完全培養(yǎng)基。當(dāng)密度達(dá)到80%以上時(shí)傳代。
【常見問題】
1、H9C2細(xì)胞可以傳幾代?
H9C2細(xì)胞系理論上是可以無(wú)限傳代的，但是研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞系也會(huì)有老化的；收到細(xì)胞后自己具體可以傳多少代，會(huì)受到客戶自己養(yǎng)細(xì)胞的操作水平技術(shù)，操作環(huán)境，用的試劑耗材的質(zhì)量等因素影響。
2、為什么H9C2細(xì)胞培養(yǎng)長(zhǎng)得慢？
這些因素都會(huì)影響細(xì)胞長(zhǎng)得慢：1）可能是細(xì)胞接種得太少，細(xì)胞密度太低�？梢韵扰囵B(yǎng)，然后消化重新鋪瓶，提高密度培養(yǎng)；2）操作時(shí)力度沒控制好，將細(xì)胞吹碎，狀態(tài)變差；3）血清質(zhì)量不好，影響細(xì)胞生長(zhǎng)
3、為什么H9C2細(xì)胞培養(yǎng)會(huì)出現(xiàn)空泡？
1）可能是鋪板時(shí)鋪得不夠均勻，局部過于密集，密集地方的細(xì)胞就開始狀態(tài)變差、空泡增多；2）也可能是血清差，需要更換優(yōu)質(zhì)血清，及時(shí)換液。
4、為什么會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞表面顆粒較多的現(xiàn)象？
可能是培養(yǎng)環(huán)境有問題，可以改用中喬新舟的完全培養(yǎng)基（貨號(hào)：ZM0102）培養(yǎng)，傳三代后會(huì)恢復(fù)平整細(xì)胞表面。
5、為什么細(xì)胞狀態(tài)變差，容易漂？
1）可能是血清問題，建議換血清，并注意血清要程序解凍，不能水浴化開
2）也有可能是細(xì)胞生長(zhǎng)密集，需要及時(shí)傳代，并不是細(xì)胞長(zhǎng)滿才傳代，當(dāng)有個(gè)別地方長(zhǎng)得過于密集，容易疊加的時(shí)候應(yīng)該就要傳代了。
【注意事項(xiàng)】
1) H9c2(2-1)細(xì)胞胞體上有黑色顆粒屬于正�，F(xiàn)象。該細(xì)胞對(duì)胎牛血清比較敏感，建議使用高質(zhì)量胎牛血清或購(gòu)買我司配套完全培養(yǎng)液。
2) 該細(xì)胞需要再密度達(dá)到60-70%左右進(jìn)行傳代，過高密度傳代會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞融合形成肌管，導(dǎo)致細(xì)胞不增長(zhǎng)。如果血清質(zhì)量不好或血清濃度降低，融合會(huì)更快產(chǎn)生。
3) 經(jīng)過長(zhǎng)期的培養(yǎng)，細(xì)胞的增殖速度會(huì)減慢。這是由于該細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的酸堿、血清等及其敏感，一旦細(xì)胞融合后就會(huì)增殖緩慢，需要定期從新克隆篩選成肌細(xì)胞。
細(xì)胞接種密度推薦1X10的4次方每平方厘米。
4) 消化時(shí)間的把控也是必不可少的一個(gè)步驟,防止未充分消化分散的細(xì)胞融合導(dǎo)致成肌管細(xì)胞的形成。
H9c2(2-1)是來(lái)源于胚胎BD1X大鼠心臟組織的原始克隆細(xì)胞系的亞克隆，具有骨骼肌的許多特性。該細(xì)胞系可用于心血管疾病的研究。該細(xì)胞表現(xiàn)出許多骨骼肌的特性，且該細(xì)胞株中的成肌細(xì)胞能融合形成多核的肌管，并對(duì)乙酰膽堿的刺激發(fā)生反應(yīng)。如果培養(yǎng)基中的血清濃度下降到1%，融合發(fā)生得很快。目前H9c2(2-1)細(xì)胞已被廣泛用于研究心臟生物學(xué)和疾病的各個(gè)方面。
H9c2(2-1)是原始克隆細(xì)胞系的亞克隆，該細(xì)胞系由Kimes .和Brandt .從胚胎BD1X大鼠心臟組織獲得，并顯示出骨骼肌的許多特性。 這個(gè)細(xì)胞株中的成肌細(xì)胞能融合形成多核的肌管，并對(duì)乙酰膽堿的刺激發(fā)生反應(yīng)。 如果培養(yǎng)基中的血清濃度下降到1%，融合發(fā)生得很快。
H9c2(2-1)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)存在少量圓形貼壁細(xì)胞，為正常的細(xì)胞增殖現(xiàn)象。細(xì)胞處于不同增殖周期，具體形態(tài)會(huì)有差異，例如分裂期細(xì)胞通常會(huì)變小變立體呈圓形甚至脫落，而分裂間期細(xì)胞會(huì)鋪展比較開，這些都是正常增殖現(xiàn)象。以下是中喬新舟拍攝的不同放大倍數(shù)的H9C2的細(xì)胞圖：
4X
10X
20X
細(xì)胞名稱：H9C2大鼠心肌細(xì)胞
細(xì)胞別名：H9c2 (2-1); H9c2; H9C2
產(chǎn)品貨號(hào)：ZQ0102
生長(zhǎng)特性：貼壁生長(zhǎng)
培養(yǎng)條件：DMEM高糖（品牌：中喬新舟 貨號(hào)：ZQ-100）+10%FBS（品牌：中喬新舟 貨號(hào)：ZQ500-A）+1%雙抗（中喬新舟 貨號(hào)：CSP006）
完全培養(yǎng)基貨號(hào)：ZM0102
培養(yǎng)環(huán)境：95%空氣，5%二氧化碳；37℃
【傳代培養(yǎng)】
該細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)：
1、細(xì)胞有脫落情況時(shí)，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌離心管中，離心（125g，3～5分鐘）1000-1200rmp收集懸浮細(xì)胞（漂浮細(xì)胞少，可能無(wú)沉淀，大部分在管壁上）；輕柔去除培養(yǎng)基，等貼壁細(xì)胞消化收集在一起混勻接種。
2、貼壁細(xì)胞用PBS洗1~2次，每次3-5ml，添加1ml 胰酶（0.25% 含EDTA）到細(xì)胞瓶中，輕輕搖勻，使胰酶溶液鋪滿細(xì)胞表面，放入培養(yǎng)箱中。1-3min后取出到顯微鏡下觀察，(若細(xì)胞無(wú)變化繼續(xù)放入培養(yǎng)箱消化)一旦細(xì)胞變圓、輕拍瓶尾部大部分細(xì)胞開始脫落，當(dāng)達(dá)到70-80%細(xì)胞漂浮脫落，立即加入5ml完全培養(yǎng)基(含10%FBS)中和。用移液管輕輕吹打6-8次，使細(xì)胞充分解離。
3、將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌離心管中，計(jì)數(shù)，離心收集細(xì)胞。用適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，使細(xì)胞密度為每毫升0.6-2X105。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶中，靜置于培養(yǎng)箱中。建議T25培養(yǎng)瓶添加5-7ml完全培養(yǎng)基，以后2-3天進(jìn)行換液。
【細(xì)胞凍存】
1、細(xì)胞密度80%以上，活細(xì)胞百分率達(dá)95%以上時(shí)，將細(xì)胞按照以上步驟進(jìn)行消化收集細(xì)胞沉淀進(jìn)行凍存。
2、細(xì)胞沉淀用適量4°C凍存液（貨號(hào)：CSP042）重懸， 建議一瓶T25細(xì)胞凍存一管（1ml/管），直接將分裝好的細(xì)胞凍存管置于-80℃超低溫冰箱中過夜，若需液氮長(zhǎng)期保存，需先置于-80℃至少一天后方可轉(zhuǎn)至液氮罐中。
NOTE:若不是我司凍存液請(qǐng)按照凍存液說明書操作，若是自配凍存液需梯度降溫凍存(2-8℃，放置 40min:-20℃,放置 30min-60min，-80℃放置一天后轉(zhuǎn)移至液氮保存)或使用程序降溫盒降溫后，再轉(zhuǎn)移至液氮中保存。
【細(xì)胞復(fù)蘇】
1、液氮取出的細(xì)胞放入干冰中轉(zhuǎn)移至細(xì)胞房，提前準(zhǔn)備好完全培養(yǎng)基，離心管等試劑和耗材。
2、凍管細(xì)胞在37°C水浴中迅速解凍（大約1-2分鐘）。為了減少污染的可能性，保持凍管瓶蓋在水浴液面之上。 一旦大部分內(nèi)容物解凍，立即將凍管移出水浴，70%的乙醇消毒凍管外壁。
3、將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到含3-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中，輕輕混勻，離心（125 g，3～5分鐘）1000-1200rmp去除培養(yǎng)基， 管底細(xì)胞沉淀用手指彈松，再添加3ml完全培養(yǎng)基至離心管內(nèi)混勻細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)。
4、用適量完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至0.6-2.0X105，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，再將瓶轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。T25培養(yǎng)瓶建議添加5-7ml完全培養(yǎng)基。當(dāng)密度達(dá)到80%以上時(shí)傳代。
【常見問題】
1、H9C2細(xì)胞可以傳幾代?
H9C2細(xì)胞系理論上是可以無(wú)限傳代的，但是研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞系也會(huì)有老化的；收到細(xì)胞后自己具體可以傳多少代，會(huì)受到客戶自己養(yǎng)細(xì)胞的操作水平技術(shù)，操作環(huán)境，用的試劑耗材的質(zhì)量等因素影響。
2、為什么H9C2細(xì)胞培養(yǎng)長(zhǎng)得慢？
這些因素都會(huì)影響細(xì)胞長(zhǎng)得慢：1）可能是細(xì)胞接種得太少，細(xì)胞密度太低�？梢韵扰囵B(yǎng)，然后消化重新鋪瓶，提高密度培養(yǎng)；2）操作時(shí)力度沒控制好，將細(xì)胞吹碎，狀態(tài)變差；3）血清質(zhì)量不好，影響細(xì)胞生長(zhǎng)
3、為什么H9C2細(xì)胞培養(yǎng)會(huì)出現(xiàn)空泡？
1）可能是鋪板時(shí)鋪得不夠均勻，局部過于密集，密集地方的細(xì)胞就開始狀態(tài)變差、空泡增多；2）也可能是血清差，需要更換優(yōu)質(zhì)血清，及時(shí)換液。
4、為什么會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞表面顆粒較多的現(xiàn)象？
可能是培養(yǎng)環(huán)境有問題，可以改用中喬新舟的完全培養(yǎng)基（貨號(hào)：ZM0102）培養(yǎng)，傳三代后會(huì)恢復(fù)平整細(xì)胞表面。
5、為什么細(xì)胞狀態(tài)變差，容易漂？
1）可能是血清問題，建議換血清，并注意血清要程序解凍，不能水浴化開
2）也有可能是細(xì)胞生長(zhǎng)密集，需要及時(shí)傳代，并不是細(xì)胞長(zhǎng)滿才傳代，當(dāng)有個(gè)別地方長(zhǎng)得過于密集，容易疊加的時(shí)候應(yīng)該就要傳代了。
【注意事項(xiàng)】
1) H9c2(2-1)細(xì)胞胞體上有黑色顆粒屬于正�，F(xiàn)象。該細(xì)胞對(duì)胎牛血清比較敏感，建議使用高質(zhì)量胎牛血清或購(gòu)買我司配套完全培養(yǎng)液。
2) 該細(xì)胞需要再密度達(dá)到60-70%左右進(jìn)行傳代，過高密度傳代會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞融合形成肌管，導(dǎo)致細(xì)胞不增長(zhǎng)。如果血清質(zhì)量不好或血清濃度降低，融合會(huì)更快產(chǎn)生。
3) 經(jīng)過長(zhǎng)期的培養(yǎng)，細(xì)胞的增殖速度會(huì)減慢。這是由于該細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的酸堿、血清等及其敏感，一旦細(xì)胞融合后就會(huì)增殖緩慢，需要定期從新克隆篩選成肌細(xì)胞。
細(xì)胞接種密度推薦1X10的4次方每平方厘米。
4) 消化時(shí)間的把控也是必不可少的一個(gè)步驟,防止未充分消化分散的細(xì)胞融合導(dǎo)致成肌管細(xì)胞的形成。
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