不同海藻糖復(fù)合型冷凍保護(hù)劑對多能干細(xì)胞的低溫保護(hù)能力研究
包括干細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞治療產(chǎn)品具有很高的臨床潛力，全球干細(xì)胞市場包括上中游的干細(xì)胞存儲制備以及下游的臨床應(yīng)用。
為了使細(xì)胞產(chǎn)品成功應(yīng)用，細(xì)胞的長期低溫存儲是必須攻克的技術(shù)難點(diǎn)，因?yàn)榈蜏乇４媸情L期保存細(xì)胞活力和生化功能的治療可用方法。為了避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損害，一些生物制劑凍干保護(hù)劑，冷凍保護(hù)劑已經(jīng)上市。常用的生物制劑凍干保護(hù)劑，冷凍保護(hù)劑是二甲基亞砜(DMSO)與胎牛血清或血清替代品聯(lián)合使用。
然而，胎牛血清含有異種動物源蛋白，可能會引起未知病原體的人畜共患。此外，DMSO具有細(xì)胞毒性。據(jù)報道，DMSO對組織和細(xì)胞的毒性取決于暴露時間、溫度和濃度。毒性程度因細(xì)胞類型而異，在未去除DMSO的情況下再次注入解凍細(xì)胞的患者中有不良反應(yīng)的報道。此外，已知DMSO會通過調(diào)節(jié)三種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmts)的轉(zhuǎn)錄水平和改變?nèi)蚪M甲基化譜來影響小鼠胚狀體的表觀基因組，進(jìn)而導(dǎo)致小鼠干細(xì)胞的不受控分化。因此二甲基亞砜+胎牛血清并不適合臨床使用，急需開發(fā)高效無毒的生物制劑凍干保護(hù)劑，細(xì)胞冷凍保護(hù)劑。
海藻糖生物制劑凍干保護(hù)劑是一種非還原性雙糖，存在于多種能夠在完全脫水狀態(tài)下存活的生物中，如細(xì)菌、酵母、緩步動物和線蟲。哺乳動物不產(chǎn)生海藻糖，但海藻糖確實(shí)是一種有效的冷凍保護(hù)劑，可以減少冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。其保護(hù)作用既與滲透效應(yīng)有關(guān)，也與細(xì)胞膜磷脂和不穩(wěn)定蛋白的特異性相互作用有關(guān)，可防止其因干燥和氧化應(yīng)激而損傷和變性。
海藻糖生物制劑凍干保護(hù)劑不具有細(xì)胞毒性，已被有效地用于小鼠精細(xì)胞、成人造血干細(xì)胞，間質(zhì)干細(xì)胞，脂肪來源干細(xì)胞，人類胚胎干細(xì)胞(hESCs) 和人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSCs) 等不同細(xì)胞類型的冷凍儲存。此外，海藻糖生物制劑凍干保護(hù)劑還用于臍帶血、骨髓、人類移植表肝細(xì)胞和人類胰島的冷凍儲存。
阻止海藻糖在細(xì)胞保存中廣泛應(yīng)用的主要障礙是其難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。以前已經(jīng)應(yīng)用了幾種方法，如滲透休克、脂質(zhì)體遞送、熱穿孔、電穿孔、微量注射和基因工程等方式來幫助海藻糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。然而，上述方法需要非常繁瑣的操作，費(fèi)力耗時，且可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷。
該研究探究了在沒有二甲基亞砜及胎牛血清的情況下，使用海藻糖單獨(dú)或與乙二醇(乙二醇)或甘油(甘油)聯(lián)合，配制了4種不同的海藻糖復(fù)合型冷凍保護(hù)劑，低溫保存3種不同類型的多能干細(xì)胞系并復(fù)蘇，對幾個關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了治療研究，包括細(xì)胞形態(tài)、解凍后生存能力、多能性標(biāo)記物表達(dá)水平、基因組穩(wěn)定性、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)穩(wěn)態(tài)、DNA損傷反應(yīng)等，以衡量不同海藻糖復(fù)合型冷凍保護(hù)劑對多能干細(xì)胞的低溫保護(hù)能力。
1. 不同冷凍保護(hù)劑組成
所有冷凍保護(hù)劑均現(xiàn)用現(xiàn)配，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋。實(shí)驗(yàn)中用到的細(xì)胞均使用CS10冷凍保存。CS10是一種無血清，無動物源成分，含有10% DMSO，推薦用于人類多能干細(xì)胞(hPSCs)的冷凍保護(hù)劑。
2. 細(xì)胞的冷凍保存及解凍
細(xì)胞在特定條件下培養(yǎng)，用0.5 mM EDTA解離hESCs RC17，用細(xì)胞消化液解離hiPSCs CTR2#6和AF22，并在新鮮制備的冷凍保護(hù)劑(A,B,C和D)中處理。2.0×10^6細(xì)胞在每種冷凍保護(hù)劑1.5 mL中重懸，然后轉(zhuǎn)移到低溫小瓶中。
低溫小瓶使用冷凍容器進(jìn)行冷卻，該容器冷卻速率約為-1°C/min，放置過夜后，轉(zhuǎn)移到- 80°C冰箱。再24小時后，將低溫小瓶轉(zhuǎn)移到液氮中，并在分析前存儲至少一周。
解凍時，取出低溫小瓶，37°C水浴加熱直至冰團(tuán)消失，細(xì)胞懸液用溫暖的培養(yǎng)基稀釋。以200g離心3分鐘收集細(xì)胞，并以指定的接種量將其接種到適合每種細(xì)胞類型的包被培養(yǎng)容器上。
3. 結(jié)果與討論
①細(xì)胞活力
解凍48 h后，用阿拉瑪藍(lán)法測定細(xì)胞活力。
首先，為了確定海藻糖、乙二醇、甘油單獨(dú)使用時的適宜用量。在不同干細(xì)胞系中分別使用不同濃度的單組分溶液，測試細(xì)胞復(fù)蘇后的活力并與對照組進(jìn)行比對。結(jié)果表明0.5M 海藻糖，10%乙二醇和10%甘油是較為適宜的濃度，但在不同的干細(xì)胞類型之間存在很大的差異。
確定初始濃度后，選定4種冷凍保護(hù)劑配方（詳見上文），對三種干細(xì)胞系(A) hESCs-RC17， (B) hiPSCs-CTR2#6和(C) ltNES-AF22進(jìn)行冷凍保存及復(fù)蘇，進(jìn)行細(xì)胞冷凍復(fù)蘇后活力檢測。并將細(xì)胞存活率與在CS10中冷凍保存的相同細(xì)胞在相同條件下進(jìn)行比較。
當(dāng)細(xì)胞海藻糖(冷凍保護(hù)劑A組)冷凍保存時，解凍后的細(xì)胞恢復(fù)率降低，不同干細(xì)胞類型的細(xì)胞恢復(fù)率從20%到60%不等。
在以海藻糖為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基中添加10% 乙二醇或甘油時(冷凍保護(hù)劑C組、D組)，RC17和AF22細(xì)胞的細(xì)胞存活率都達(dá)到了與DMSO相似的水平，而在CTR2#6中，甘油的細(xì)胞存活率優(yōu)于乙二醇。
此外，對比由乙二醇或甘油組成的對照冷凍溶液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以確認(rèn)細(xì)胞存活率的增加是乙二醇/甘油+海藻糖聯(lián)合作用的結(jié)果。
這些結(jié)果表明，海藻糖可以有效地用于人類多能干細(xì)胞的冷凍保存，有望替代DMSO，添加10% 乙二醇或甘油可提高海藻糖冷凍保護(hù)劑的存活率。與對照組CS10相比，細(xì)胞平均存活率增加。乙二醇/甘油+海藻糖組成的冷凍保護(hù)劑不含血清蛋白，避免了先前報道的刺激多能干細(xì)胞過早分化的風(fēng)險。
②細(xì)胞形態(tài)
干細(xì)胞凍存另一個重點(diǎn)關(guān)注的問題是染色體和多能性改變。冷凍和解凍過程可能在細(xì)胞內(nèi)外形成冰晶和氣泡，破壞紡錘體微管進(jìn)而誘導(dǎo)染色體異常分離，導(dǎo)致細(xì)胞生長特征和形態(tài)變化。因此，可通過觀察凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞形態(tài)來較為直觀地評估干細(xì)胞染色體及多能潛力受到損害的可能性。
上圖顯示了解凍48小時后RC17、CTR2#6和AF22的細(xì)胞形態(tài)。相位對比圖像證實(shí)，在所有細(xì)胞系中，海藻糖復(fù)合冷凍保護(hù)劑均未引起明顯的形態(tài)變化，細(xì)胞形態(tài)與CS10中保存的細(xì)胞相同。
③標(biāo)志物表達(dá)水平
為了確認(rèn)凍存復(fù)蘇后的RC17、hiPSCs CTR2#6和AF22保留了多能干細(xì)胞的關(guān)鍵性質(zhì)和特征，在解凍48 h后通過定量RT-PCR分析幾個標(biāo)記物的表達(dá)水平。
對RC17和CTR2#6細(xì)胞檢測細(xì)胞標(biāo)記Nanog, Oct4和Sox2。與對照組進(jìn)行比對。
對AF22細(xì)胞檢測細(xì)胞標(biāo)記Nestin和Sox2。與對照組進(jìn)行比對。結(jié)果顯示干細(xì)胞分化潛能未受影響。
④染色體穩(wěn)定性
為了評估海藻糖冷凍保護(hù)劑對干細(xì)胞染色體穩(wěn)定性的影響，對所有三種干細(xì)胞系進(jìn)行常規(guī)核型分型和aCGH，下圖為AF22細(xì)胞系儲存前后的結(jié)果。
總體而言核型保持穩(wěn)定，但檢測到少量CNVs(染色體2、8、19和22)，其中一些可能已經(jīng)存在于原始細(xì)胞群中，另一些可能是在細(xì)胞體外操作過程中隨機(jī)產(chǎn)生的，而不是冷凍保存導(dǎo)致，因?yàn)樵趦Υ媲?圖C)和儲存后(圖D)均未觀察到克隆非整倍體或結(jié)構(gòu)染色體畸變。
⑤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/未折疊蛋白水平評估
該研究還關(guān)注了在CS10或海藻糖中低溫保存是否會對多能細(xì)胞響應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR通路的能力產(chǎn)生負(fù)面影響。為了在不同的生理或病理狀態(tài)下維持穩(wěn)態(tài)，ER整合了各種分子和細(xì)胞信號。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR都介導(dǎo)影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡的分子和生化機(jī)制。
總體而言，與對照組CS10相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/UPR反應(yīng)水平適中。一種更敏感的細(xì)胞系是CTR2#6，在實(shí)驗(yàn)組B和C中顯示出更高水平的BIP和CHOP水平。表明與CS10相比，海藻糖低溫保存不會明顯改變多能干細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）穩(wěn)態(tài)。
為了使細(xì)胞產(chǎn)品成功應(yīng)用，細(xì)胞的長期低溫存儲是必須攻克的技術(shù)難點(diǎn)，因?yàn)榈蜏乇４媸情L期保存細(xì)胞活力和生化功能的治療可用方法。為了避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損害，一些生物制劑凍干保護(hù)劑，冷凍保護(hù)劑已經(jīng)上市。常用的生物制劑凍干保護(hù)劑，冷凍保護(hù)劑是二甲基亞砜(DMSO)與胎牛血清或血清替代品聯(lián)合使用。
然而，胎牛血清含有異種動物源蛋白，可能會引起未知病原體的人畜共患。此外，DMSO具有細(xì)胞毒性。據(jù)報道，DMSO對組織和細(xì)胞的毒性取決于暴露時間、溫度和濃度。毒性程度因細(xì)胞類型而異，在未去除DMSO的情況下再次注入解凍細(xì)胞的患者中有不良反應(yīng)的報道。此外，已知DMSO會通過調(diào)節(jié)三種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmts)的轉(zhuǎn)錄水平和改變?nèi)蚪M甲基化譜來影響小鼠胚狀體的表觀基因組，進(jìn)而導(dǎo)致小鼠干細(xì)胞的不受控分化。因此二甲基亞砜+胎牛血清并不適合臨床使用，急需開發(fā)高效無毒的生物制劑凍干保護(hù)劑，細(xì)胞冷凍保護(hù)劑。
海藻糖生物制劑凍干保護(hù)劑是一種非還原性雙糖，存在于多種能夠在完全脫水狀態(tài)下存活的生物中，如細(xì)菌、酵母、緩步動物和線蟲。哺乳動物不產(chǎn)生海藻糖，但海藻糖確實(shí)是一種有效的冷凍保護(hù)劑，可以減少冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。其保護(hù)作用既與滲透效應(yīng)有關(guān)，也與細(xì)胞膜磷脂和不穩(wěn)定蛋白的特異性相互作用有關(guān)，可防止其因干燥和氧化應(yīng)激而損傷和變性。
海藻糖生物制劑凍干保護(hù)劑不具有細(xì)胞毒性，已被有效地用于小鼠精細(xì)胞、成人造血干細(xì)胞，間質(zhì)干細(xì)胞，脂肪來源干細(xì)胞，人類胚胎干細(xì)胞(hESCs) 和人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSCs) 等不同細(xì)胞類型的冷凍儲存。此外，海藻糖生物制劑凍干保護(hù)劑還用于臍帶血、骨髓、人類移植表肝細(xì)胞和人類胰島的冷凍儲存。
阻止海藻糖在細(xì)胞保存中廣泛應(yīng)用的主要障礙是其難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。以前已經(jīng)應(yīng)用了幾種方法，如滲透休克、脂質(zhì)體遞送、熱穿孔、電穿孔、微量注射和基因工程等方式來幫助海藻糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。然而，上述方法需要非常繁瑣的操作，費(fèi)力耗時，且可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷。
該研究探究了在沒有二甲基亞砜及胎牛血清的情況下，使用海藻糖單獨(dú)或與乙二醇(乙二醇)或甘油(甘油)聯(lián)合，配制了4種不同的海藻糖復(fù)合型冷凍保護(hù)劑，低溫保存3種不同類型的多能干細(xì)胞系并復(fù)蘇，對幾個關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了治療研究，包括細(xì)胞形態(tài)、解凍后生存能力、多能性標(biāo)記物表達(dá)水平、基因組穩(wěn)定性、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)穩(wěn)態(tài)、DNA損傷反應(yīng)等，以衡量不同海藻糖復(fù)合型冷凍保護(hù)劑對多能干細(xì)胞的低溫保護(hù)能力。
1. 不同冷凍保護(hù)劑組成
| 組別 | 成分 |
| A | 0.5M 海藻糖 |
| B | 0.5M 海藻糖+2.5% 乙二醇 |
| C | 0.5M 海藻糖+10% 乙二醇 |
| D | 0.5M 海藻糖+10% 甘油 |
2. 細(xì)胞的冷凍保存及解凍
細(xì)胞在特定條件下培養(yǎng)，用0.5 mM EDTA解離hESCs RC17，用細(xì)胞消化液解離hiPSCs CTR2#6和AF22，并在新鮮制備的冷凍保護(hù)劑(A,B,C和D)中處理。2.0×10^6細(xì)胞在每種冷凍保護(hù)劑1.5 mL中重懸，然后轉(zhuǎn)移到低溫小瓶中。
低溫小瓶使用冷凍容器進(jìn)行冷卻，該容器冷卻速率約為-1°C/min，放置過夜后，轉(zhuǎn)移到- 80°C冰箱。再24小時后，將低溫小瓶轉(zhuǎn)移到液氮中，并在分析前存儲至少一周。
解凍時，取出低溫小瓶，37°C水浴加熱直至冰團(tuán)消失，細(xì)胞懸液用溫暖的培養(yǎng)基稀釋。以200g離心3分鐘收集細(xì)胞，并以指定的接種量將其接種到適合每種細(xì)胞類型的包被培養(yǎng)容器上。
3. 結(jié)果與討論
①細(xì)胞活力
解凍48 h后，用阿拉瑪藍(lán)法測定細(xì)胞活力。
首先，為了確定海藻糖、乙二醇、甘油單獨(dú)使用時的適宜用量。在不同干細(xì)胞系中分別使用不同濃度的單組分溶液，測試細(xì)胞復(fù)蘇后的活力并與對照組進(jìn)行比對。結(jié)果表明0.5M 海藻糖，10%乙二醇和10%甘油是較為適宜的濃度，但在不同的干細(xì)胞類型之間存在很大的差異。
確定初始濃度后，選定4種冷凍保護(hù)劑配方（詳見上文），對三種干細(xì)胞系(A) hESCs-RC17， (B) hiPSCs-CTR2#6和(C) ltNES-AF22進(jìn)行冷凍保存及復(fù)蘇，進(jìn)行細(xì)胞冷凍復(fù)蘇后活力檢測。并將細(xì)胞存活率與在CS10中冷凍保存的相同細(xì)胞在相同條件下進(jìn)行比較。
當(dāng)細(xì)胞海藻糖(冷凍保護(hù)劑A組)冷凍保存時，解凍后的細(xì)胞恢復(fù)率降低，不同干細(xì)胞類型的細(xì)胞恢復(fù)率從20%到60%不等。
在以海藻糖為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基中添加10% 乙二醇或甘油時(冷凍保護(hù)劑C組、D組)，RC17和AF22細(xì)胞的細(xì)胞存活率都達(dá)到了與DMSO相似的水平，而在CTR2#6中，甘油的細(xì)胞存活率優(yōu)于乙二醇。
此外，對比由乙二醇或甘油組成的對照冷凍溶液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以確認(rèn)細(xì)胞存活率的增加是乙二醇/甘油+海藻糖聯(lián)合作用的結(jié)果。
這些結(jié)果表明，海藻糖可以有效地用于人類多能干細(xì)胞的冷凍保存，有望替代DMSO，添加10% 乙二醇或甘油可提高海藻糖冷凍保護(hù)劑的存活率。與對照組CS10相比，細(xì)胞平均存活率增加。乙二醇/甘油+海藻糖組成的冷凍保護(hù)劑不含血清蛋白，避免了先前報道的刺激多能干細(xì)胞過早分化的風(fēng)險。
②細(xì)胞形態(tài)
干細(xì)胞凍存另一個重點(diǎn)關(guān)注的問題是染色體和多能性改變。冷凍和解凍過程可能在細(xì)胞內(nèi)外形成冰晶和氣泡，破壞紡錘體微管進(jìn)而誘導(dǎo)染色體異常分離，導(dǎo)致細(xì)胞生長特征和形態(tài)變化。因此，可通過觀察凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞形態(tài)來較為直觀地評估干細(xì)胞染色體及多能潛力受到損害的可能性。
上圖顯示了解凍48小時后RC17、CTR2#6和AF22的細(xì)胞形態(tài)。相位對比圖像證實(shí)，在所有細(xì)胞系中，海藻糖復(fù)合冷凍保護(hù)劑均未引起明顯的形態(tài)變化，細(xì)胞形態(tài)與CS10中保存的細(xì)胞相同。
③標(biāo)志物表達(dá)水平
為了確認(rèn)凍存復(fù)蘇后的RC17、hiPSCs CTR2#6和AF22保留了多能干細(xì)胞的關(guān)鍵性質(zhì)和特征，在解凍48 h后通過定量RT-PCR分析幾個標(biāo)記物的表達(dá)水平。
對RC17和CTR2#6細(xì)胞檢測細(xì)胞標(biāo)記Nanog, Oct4和Sox2。與對照組進(jìn)行比對。
對AF22細(xì)胞檢測細(xì)胞標(biāo)記Nestin和Sox2。與對照組進(jìn)行比對。結(jié)果顯示干細(xì)胞分化潛能未受影響。
④染色體穩(wěn)定性
為了評估海藻糖冷凍保護(hù)劑對干細(xì)胞染色體穩(wěn)定性的影響，對所有三種干細(xì)胞系進(jìn)行常規(guī)核型分型和aCGH，下圖為AF22細(xì)胞系儲存前后的結(jié)果。
總體而言核型保持穩(wěn)定，但檢測到少量CNVs(染色體2、8、19和22)，其中一些可能已經(jīng)存在于原始細(xì)胞群中，另一些可能是在細(xì)胞體外操作過程中隨機(jī)產(chǎn)生的，而不是冷凍保存導(dǎo)致，因?yàn)樵趦Υ媲?圖C)和儲存后(圖D)均未觀察到克隆非整倍體或結(jié)構(gòu)染色體畸變。
⑤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/未折疊蛋白水平評估
該研究還關(guān)注了在CS10或海藻糖中低溫保存是否會對多能細(xì)胞響應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR通路的能力產(chǎn)生負(fù)面影響。為了在不同的生理或病理狀態(tài)下維持穩(wěn)態(tài)，ER整合了各種分子和細(xì)胞信號。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR都介導(dǎo)影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡的分子和生化機(jī)制。
總體而言，與對照組CS10相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/UPR反應(yīng)水平適中。一種更敏感的細(xì)胞系是CTR2#6，在實(shí)驗(yàn)組B和C中顯示出更高水平的BIP和CHOP水平。表明與CS10相比，海藻糖低溫保存不會明顯改變多能干細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）穩(wěn)態(tài)。
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