四種評價免疫細胞對腫瘤細胞殺傷活性檢測方法的優(yōu)缺點

2024年2月16日，TIL細胞藥物獲得FDA批準(zhǔn)上市，這是基因和細胞治療領(lǐng)域的重大突破，也是腫瘤免疫治療領(lǐng)域的眾望所歸！
 

近年來，免疫細胞療法作為一種新興的治療手段，在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力。通過向腫瘤患者輸入具有抗腫瘤活性的免疫細胞，直接殺傷腫瘤細胞或激發(fā)集體抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而達到治療腫瘤的目的。截至2023年6月，全球生物制藥行業(yè)中有1989種細胞治療類管線處于臨床前或臨床階段[1]，其中，免疫細胞的殺傷活性是評價免疫細胞療法治療效果的一個重要因素。
 

小分子藥和ADC藥物在體外評價對腫瘤細胞的殺傷作用時，通常采用經(jīng)典的基于ATP的方法來檢測腫瘤細胞的活力 (逐典貨號CY074F0100KIT)，ATP作為細胞新陳代謝的一個重要指標(biāo)，在一定范圍內(nèi)與活細胞數(shù)目呈良好的線性關(guān)系，是細胞活力檢測的重要標(biāo)志性分子。免疫細胞腫瘤殺傷活性的體外評價一般會涉及免疫細胞和腫瘤細胞兩種細胞，因此不能采取基于ATP的檢測手段，常用的方法有熒光素酶報告基因檢測、放射性同位素51Cr釋放檢測、LDH活性光吸收檢測和EuTDA細胞毒法，下面我們來盤點這四種檢測方法的優(yōu)劣勢，以供大家進行選擇。
 

將熒光素酶報告基因?qū)�入靶細胞，活的靶細胞會表達熒光素酶，加入熒光素酶報告基因檢測試劑 (逐典貨號CY058F0100KIT) 后釋放出光信號，活的靶細胞數(shù)量與釋放出的光信號成正比，從而可以評判免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。

優(yōu)勢：

① 靈敏度高, 背景值低。

② 同時測定對多種靶細胞的殺傷作用。用不同報告基因轉(zhuǎn)染的細胞系可同時測定殺傷效應(yīng), 結(jié)果互不干擾。

③ 機制研究。用不同的基因調(diào)控元件控制報告基因的表達，可進一步研究作用機制。

不足：

周期相對較長。建立報告基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系實驗周期較長。

圖1. 螢火蟲熒光素酶發(fā)光原理

用放射性51Cr標(biāo)記靶細胞，在效應(yīng)細胞殺傷靶細胞的過程中，靶細胞由于細胞膜失去完整性，向培養(yǎng)基中釋放51Cr，培養(yǎng)基中的51Cr與被殺死的靶細胞數(shù)量成正比，從而評估免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用[2]。

優(yōu)勢：

測量細胞介導(dǎo)的細胞毒性的金標(biāo)準(zhǔn)。

不足：

① 51Cr放射性對研究者的健康狀況有一定的影響。

② 對昂貴設(shè)備和專業(yè)人員的需求能力沒有得到相對普及。

圖2. 51Cr釋放測定原理。該過程分為3個主要步驟：51Cr標(biāo)記靶細胞，通過細胞裂解釋放51Cr以及檢測釋放的51Cr

正常情況下，乳酸脫氫酶 (LDH) 存在于活細胞胞漿內(nèi)，不能透過細胞膜，當(dāng)細胞受到損傷時，LDH可以透過細胞膜釋放到培養(yǎng)基中。釋放出來的LDH和被殺傷的靶細胞成正比，利用酶標(biāo)儀讀取OD值，即可評估殺傷細胞的活性。

優(yōu)勢：

① 方法簡單，可測的通量比較高。

② 成本相對比較低。

不足：

① 如果效應(yīng)細胞狀態(tài)不好，會出現(xiàn)數(shù)據(jù)重復(fù)性不好、結(jié)果不穩(wěn)定的情況。效應(yīng)細胞狀態(tài)與個體間的差異及凍存復(fù)蘇等均有關(guān)。

② LDH可能存在部分自發(fā)釋放現(xiàn)象，導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

EuTDA的檢測原理與51Cr測定法相似，乙酰酯化的BATDA能迅速進入靶細胞，并在水解作用下形成TDA留在靶細胞內(nèi)，在細胞受到損傷后釋放到胞外的TDA與熒光探針Eu3+ 形成Eu-TDA 復(fù)合物，通過檢測Eu-TDA 的時間分辨熒光信號，來評價免疫細胞對腫瘤細胞的特異殺傷活性。

優(yōu)勢：

靈敏度高、安全性好，對于非特異性死亡的干擾較小。
 

逐典生物螢光素酶報告基因檢測試劑盒旨在準(zhǔn)確、靈敏、高效地測定螢火蟲螢光素酶活性，針對報告基因檢測不同的側(cè)重需求，逐典推出了3種檢測系統(tǒng)。

 

產(chǎn)品特點：

1.檢測靈敏度高，信號穩(wěn)定性好

HEK293-NFκB-LUC細胞加入梯度稀釋的TNFα 在37°C、5% CO2條件下刺激6小時后，分別用增強型、超敏型、穩(wěn)定型檢測試劑進行信號檢測。

2.操作方便

僅需將底物和螢光素酶檢測緩沖液混合后直接加入到細胞即可。

3.穩(wěn)定性好

同時在10次反復(fù)凍融實驗中，逐典全系列報告基因檢測試劑盒顯示出較強的穩(wěn)定性。

 

參考文獻

【1】http://doi.org/10.1016/j.ymthe.2023.11.001

【2】Kiesgen S, Messinger JC, Chintala NK, et al. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 2021 Mar;16(3):1331-1342. doi: 10.1038/s41596-020-00467-0.