CAR結構設計策略及體外抗腫瘤活性評估介紹常見問題匯總與解答

7月11日，賽業(yè)生物細胞治療部體外藥效項目管理宋子曦主講「CAR結構設計策略及體外抗腫瘤活性評估介紹」線上課程，以下為本次直播常見問題匯總與解答。

FAQ:
1.靶分子在T細胞表面高表達的情況下開發(fā)CAR-T的風險和對應策略？
2.裸鼠可以用于荷瘤并進行CAR-T治療研究嗎？
3.靶向小鼠和人的CAR-T設計區(qū)別是？
4.CAR分子設計應該給氨基酸還是核苷酸序列，如何優(yōu)化？
5.轉(zhuǎn)染NK的慢病毒滴度要求達到多高？
6.CAR分子載體的長度是多少？
 

Q：靶分子在T細胞表面高表達的情況下開發(fā)CAR-T的風險和對應策略？
A：如果靶分子在T細胞表面也高表達，開發(fā)針對該靶分子的CAR-T細胞可能會導致自殺效應或自我損傷。因此，以下策略可以考慮：
a.選擇不同的靶分子：選擇腫瘤特異性表達的分子作為靶點。
b.優(yōu)化CAR設計：使用更精確的抗原識別結構域，減少對正常T細胞的識別。
c.使用雙特異性CAR：設計能識別兩個不同靶點的CAR，提高特異性，減少對正常細胞的毒性。
d.基因編輯：敲除或調(diào)控T細胞表面高表達的靶分子，以避免自殺效應。

Q：裸鼠可以用于荷瘤并進行CAR-T治療研究嗎？
A：可以。不過裸鼠（Nude mice）缺乏胸腺，導致T細胞缺陷，但是仍保留部分免疫功能，如B細胞和自然殺傷細胞（NK細胞），這可能影響研究結果。如果條件允許的情況下更推薦使用賽業(yè)生物NKG小鼠，NKG小鼠缺乏T細胞、B細胞和NK細胞，是目前最免疫缺陷的小鼠模型之一，能夠更好地接受人類細胞移植。

Q：靶向小鼠和人的CAR-T設計區(qū)別是？
A：簡單來說，靶向小鼠和人的CAR-T設計的區(qū)別主要在于以下幾個方面：
a.抗原特異性：由于小鼠和人的基因不同，它們表達的腫瘤抗原也不同。因此，CAR-T細胞設計時，針對小鼠的會使用識別小鼠抗原的特異性抗體片段，而針對人的則會使用識別人類抗原的特異性抗體片段。
b.設計和生產(chǎn)細節(jié)：雖然CAR-T設計的基本原理相同，但在具體實現(xiàn)時，如啟動子選擇、信號傳導結構域的優(yōu)化等方面，可能需要根據(jù)目標物種的特性進行調(diào)整。

Q：CAR分子設計應該給氨基酸還是核苷酸序列，如何優(yōu)化？
A ：CAR分子設計提供氨基酸序列或核苷酸序列都可以，我們得到序列后會進行對應物種的密碼子優(yōu)化。
關于CAR結構設計上的優(yōu)化包括增加細胞內(nèi)信號序列、調(diào)整跨膜區(qū)域、選擇合適的共刺激因子等等。

Q：轉(zhuǎn)染NK的慢病毒滴度要求達到多高？
A：轉(zhuǎn)染NK細胞的慢病毒滴度要求可以因?qū)嶒灄l件和目的而異。一般來說，需要足夠高的滴度確保高效率的轉(zhuǎn)染。常見的要求一般在10^8 TU/ml以上。如果提供病毒滴度或MOI仍然得不到較高的準染效率，可以考慮通過轉(zhuǎn)座子載體電轉(zhuǎn)NK進行CAR-NK的制備。

Q：CAR分子載體的長度是多少？
A: CAR分子載體的長度取決于其組成部分。一個典型的CAR分子載體包含以下主要部分：
a.單鏈抗體片段（scFv）：大約750-800個堿基。
b.鉸鏈區(qū)（Hinge region）：大約150-300個堿基。
c.跨膜區(qū)（Transmembrane domain）：大約150-300個堿基。
d.共刺激信號域（Co-stimulatory domain）：如CD28或4-1BB，大約200-300個堿基。
e.激活信號域（Signaling domain）：如CD3ζ鏈，大約150-300個堿基。

總的來說，整個CAR分子的核苷酸序列長度大約在1500-2000個堿基對之間。這是一個概略的估計，具體長度可能會根據(jù)不同的設計和優(yōu)化有所變化。