無需切片，LED光漂白技術實現(xiàn)腫瘤微環(huán)境三維成像
在腫瘤研究領域，深入探究腫瘤微環(huán)境對于理解腫瘤的生長、轉移以及治療反應至關重要。腫瘤微環(huán)境是一個復雜的三維生態(tài)系統(tǒng)，包含了惡性癌細胞、血管細胞、免疫細胞和基質細胞等多種細胞類型以及細胞外基質等非細胞組分。這些組分之間的相互作用構成了高度扭曲且形態(tài)不規(guī)則的血管、致密的細胞外基質沉積、隨機分布的免疫細胞以及多區(qū)域的缺氧狀態(tài)。傳統(tǒng)二維成像技術難以全面展現(xiàn)這一復雜三維生態(tài)系統(tǒng)的真實面貌。
近年來，光學組織透明化與三維熒光顯微成像技術的結合為腫瘤微環(huán)境的可視化帶來了新曙光，但其多維標記能力有限，通常只能在透明化腫瘤組織中定位3或4種細胞和非細胞組分。而近期發(fā)表在《Laboratory Investigation》上的研究成果，提出了基于發(fā)光二極管（LED）光消融的方法，有望突破這一瓶頸，為深入探究腫瘤微環(huán)境的奧秘提供了全新的視角和有力工具，開啟腫瘤精準研究與治療的新篇章，為腫瘤醫(yī)學的發(fā)展帶來新的希望。
研究背景與技術挑戰(zhàn)
腫瘤微環(huán)境的復雜性剖析
腫瘤微環(huán)境是一個高度復雜且動態(tài)變化的系統(tǒng)，其復雜性體現(xiàn)在細胞類型的多樣性以及細胞與非細胞組分之間的相互作用。不同類型的細胞在腫瘤微環(huán)境中扮演著不同的角色，共同影響著腫瘤的生物學行為。例如，血管細胞為腫瘤提供營養(yǎng)和氧氣，免疫細胞則可能參與腫瘤的免疫監(jiān)視或免疫逃逸，基質細胞則對腫瘤的結構和功能有著重要的支持作用。這些細胞與細胞外基質等非細胞組分之間的相互作用，構成了腫瘤微環(huán)境的獨特生態(tài)，影響著腫瘤的生長、轉移以及對治療的反應。
盡管光學組織透明化技術與三維熒光顯微成像技術的結合為腫瘤微環(huán)境的研究提供了有力支持，但目前的三維組織顯微鏡技術受限于熒光顯微鏡的成像通道數(shù)量以及不同激發(fā)和發(fā)射波長可用熒光團的種類，使得在三維腫瘤組織中成像的細胞標記數(shù)量極為有限。這極大地阻礙了對腫瘤微環(huán)境中眾多細胞類型的空間分布、相互作用以及動態(tài)變化的全面解析，難以滿足深入探究腫瘤生物學行為和評估治療效果的迫切需求。因此，開發(fā)一種能夠突破這一瓶頸的新技術，實現(xiàn)對腫瘤微環(huán)境中多種細胞標記的高分辨率三維可視化，成為了推動腫瘤研究領域發(fā)展的重要課題。
技術創(chuàng)新與應用
LED光消融技術的開發(fā)與優(yōu)勢
為攻克三維熒光顯微成像多維標記能力受限的難題，研究團隊開發(fā)了一種高功率暖白色發(fā)光二極管（LED）光消融方法。通過構建高功率LED光照射裝置和溫控腔室，能夠在不破壞組織和蛋白質抗原完整性的前提下，完全消融透明化腫瘤組織中的熒光信號。這種LED光消融技術具有獨特的優(yōu)勢，其高能量光子能夠有效穿透整個透明化腫瘤組織，實現(xiàn)對多種熒光信號的全面去除，為后續(xù)的多標記染色和成像提供了良好的基礎。與傳統(tǒng)的熒光和抗體剝離方法相比，LED光消融技術不僅操作簡便，而且能夠避免化學試劑對組織形態(tài)和抗原的潛在損害，為三維多標記成像提供了更加穩(wěn)定和可靠的實驗條件。
研究人員建立了包含免疫熒光染色、組織透明化、三維共聚焦顯微鏡成像和LED光消融的循環(huán)工作流程。在每個工作周期中，可在整個400微米厚的小鼠腫瘤宏切片中成像最多4種不同的細胞標記。經過多個工作周期并利用LED光消融后，成功在同一個腫瘤宏切片中定位了8種不同的細胞標記，包括細胞核、血管細胞、免疫細胞以及癌細胞，實現(xiàn)了從組織層面和細胞水平對腫瘤微環(huán)境中各類血管、免疫和癌細胞的三維可視化。這一循環(huán)工作流程的建立，不僅提高了三維熒光顯微成像的多維標記能力，還實現(xiàn)了對腫瘤微環(huán)境的全面、動態(tài)和高分辨率的可視化，為深入研究腫瘤微環(huán)境提供了全新的技術手段。
成像實驗與結果分析
動物實驗模型的構建與處理
為了驗證基于LED光消融的三維多標記熒光顯微成像方法在評估癌癥免疫療法方面的應用價值，研究人員將其應用于經過干擾素基因刺激物（STING）激動劑DMXAA處理的小鼠乳腺腫瘤模型。實驗中，將TUBO細胞注射到小鼠的乳腺脂肪墊中，待腫瘤長到一定大小后，通過局部注射激動劑對小鼠進行治療。治療結束后，收集腫瘤組織樣本，進行后續(xù)的成像實驗。這種動物實驗模型的構建，為評估激動劑對腫瘤微環(huán)境的影響提供了可靠的實驗平臺，也為研究免疫療法的作用機制和效果評估奠定了基礎。
通過比較經過激動劑治療的腫瘤與未治療的對照腫瘤，對腫瘤微環(huán)境中的多種細胞類型進行了定量三維空間分析。結果顯示，在激動劑處理后的腫瘤中，癌細胞的分布變得不均勻，占細胞區(qū)域的比例降至30%以下，而對照腫瘤廣泛分布且占間質的68%以上。同時，與血管相關的血管平滑肌細胞、內皮細胞和纖維母細胞在治療腫瘤中的相對體積均低于對照腫瘤，這與激動劑誘導的腫瘤血管破壞引發(fā)強烈免疫反應的先前報道相一致。
此外，在高分辨率三維圖像中，對照腫瘤中大量免疫細胞類型位于間質區(qū)域，而在激動劑處理后的腫瘤中，細胞毒性T淋巴細胞（CTLs）的體積百分比顯著增加，與CK8+癌細胞相互作用的CTLs體積百分比也大幅上升，表明激動劑治療增強了腫瘤中CTLs的浸潤，并通過CTL介導的免疫反應消除了癌細胞。這些實驗結果不僅驗證了基于LED光消融的三維多標記成像技術的可行性和有效性，還展示了其在評估免疫療法效果方面的巨大潛力。
總結與展望
該研究成功開發(fā)了一種基于LED光消融的循環(huán)工作流程，用于光學透明化腫瘤組織的三維多標記熒光顯微成像，為深入探究腫瘤微環(huán)境的復雜性和腫瘤對治療的響應提供了創(chuàng)新性工具。這一方法突破了傳統(tǒng)三維熒光顯微成像在多維標記能力上的限制，實現(xiàn)了在單個厚腫瘤切片中對多種細胞標記的高分辨率三維可視化和定量空間分析。在臨床應用方面，該技術有望為腫瘤的精準診斷和個性化治療提供更加詳細和準確的腫瘤微環(huán)境信息，幫助醫(yī)生制定更加有效的治療方案。未來，隨著光消融時間的進一步縮短和高通量組織處理系統(tǒng)的開發(fā)，該技術有望實現(xiàn)對大型體積腫瘤組織的自動化高通量三維多標記成像。這將進一步拓展其在腫瘤研究中的應用范圍，推動腫瘤精準醫(yī)學的發(fā)展，為揭示腫瘤微環(huán)境的奧秘、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點以及優(yōu)化免疫療法策略提供更加強大的技術支持，助力科學家們在抗癌道路上不斷邁進，為腫瘤患者的精準診斷和個性化治療帶來新的希望。
聲明：本文僅用作學術目的。
Zheng J, Wu YC, Phillips EH, Cai X, Wang X, Seung-Young Lee S. Increased Multiplexity in Optical Tissue Clearing-Based Three-Dimensional Immunofluorescence Microscopy of the Tumor Microenvironment by Light-Emitting Diode Photobleaching. Lab Invest. 2024 Jun;104(6):102072.
DOI:10.1016/j.labinv.2024.102072.
