光片顯微鏡新進(jìn)展：斜面顯微鏡實(shí)時(shí)“防焦點(diǎn)漂移”技術(shù)

重要發(fā)現(xiàn)
01光學(xué)成像中的焦點(diǎn)漂移問(wèn)題
光片熒光顯微鏡（LSFM）作為一種先進(jìn)的光學(xué)成像技術(shù)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。其通過(guò)特定角度的光片照射樣品，并由另一方向的檢測(cè)系統(tǒng)收集熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的三維成像。在典型的LSFM中，照明和檢測(cè)系統(tǒng)分別由兩個(gè)相互垂直的物鏡實(shí)現(xiàn)，這就要求光片平面與檢測(cè)系統(tǒng)的焦平面精確重合。然而，在實(shí)際操作中，由于環(huán)境因素（如溫度變化、機(jī)械振動(dòng)等），檢測(cè)物鏡可能會(huì)發(fā)生焦點(diǎn)漂移，導(dǎo)致光片與焦平面的相對(duì)位置改變，從而影響成像質(zhì)量。為解決這一問(wèn)題，研究人員開(kāi)發(fā)了多種自動(dòng)對(duì)焦算法，這些算法通常需要獲取一系列熒光圖像來(lái)估算相對(duì)位移，這不僅會(huì)消耗熒光信號(hào)，還可能中斷實(shí)際成像過(guò)程。

02斜面顯微鏡（OPM）的創(chuàng)新解決方案
斜面顯微鏡（OPM）是LSFM的一種變體，它使用單個(gè)物鏡以斜角發(fā)射光片，并用同一物鏡檢測(cè)熒光。在這種設(shè)計(jì)中，如果主物鏡發(fā)生漂移，光片和檢測(cè)會(huì)以相同速率漂移，從而保持相對(duì)對(duì)齊。然而，在OPM中，遠(yuǎn)程聚焦系統(tǒng)可能會(huì)引入類(lèi)似傳統(tǒng)LSFM中的成像退化問(wèn)題。研究人員通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了在OPM中使用與熒光檢測(cè)光譜不同的激光光來(lái)穩(wěn)定遠(yuǎn)程聚焦單元，該系統(tǒng)無(wú)需熒光光即可獨(dú)立于熒光成像連續(xù)運(yùn)行。實(shí)驗(yàn)中，研究人員使用了一種特定波長(zhǎng)的激光，通過(guò)精確的光學(xué)設(shè)計(jì)和調(diào)整，使得激光光能夠在不干擾熒光檢測(cè)的情況下用于遠(yuǎn)程焦點(diǎn)的穩(wěn)定。

03實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與高精度成像
通過(guò)對(duì)激光光的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和反饋控制，研究人員實(shí)現(xiàn)了約21納米的軸向精度，并能夠在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中維持長(zhǎng)達(dá)數(shù)小時(shí)的穩(wěn)定成像。在實(shí)驗(yàn)中，研究人員展示了使用穩(wěn)定OPM對(duì)黑色素瘤癌細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白骨架進(jìn)行亞細(xì)胞成像的結(jié)果。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該遠(yuǎn)程焦點(diǎn)穩(wěn)定技術(shù)能夠在長(zhǎng)時(shí)間成像過(guò)程中保持光片與檢測(cè)焦平面的精確對(duì)齊，從而顯著提高成像質(zhì)量，并減少因焦點(diǎn)漂移導(dǎo)致的模糊。此外，研究人員還通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間成像實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該技術(shù)的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)在啟用焦點(diǎn)穩(wěn)定功能后，系統(tǒng)的軸向漂移顯著降低，成像分辨率在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持穩(wěn)定。

創(chuàng)新與亮點(diǎn)
創(chuàng)新之處在于提出了一種無(wú)需消耗樣品熒光的遠(yuǎn)程焦點(diǎn)穩(wěn)定方法，專(zhuān)門(mén)針對(duì)斜面顯微鏡（OPM）這一特殊的光片熒光顯微鏡（LSFM）變體。該方法利用與熒光檢測(cè)光譜不同的激光光，通過(guò)獨(dú)特的光學(xué)設(shè)計(jì)，使得激光光能夠在不干擾熒光信號(hào)的情況下實(shí)現(xiàn)對(duì)遠(yuǎn)程聚焦系統(tǒng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和反饋控制。這種方法不僅避免了傳統(tǒng)光片穩(wěn)定方法中因獲取熒光信號(hào)而導(dǎo)致的樣品光漂白和成像中斷問(wèn)題，還實(shí)現(xiàn)了極高的軸向精度（約21納米）和長(zhǎng)時(shí)間（數(shù)小時(shí)）的穩(wěn)定成像能力，為長(zhǎng)時(shí)間高分辨率的生物醫(yī)學(xué)成像提供了一種全新的解決方案。

總結(jié)與展望
這項(xiàng)研究為光片熒光顯微鏡（LSFM）領(lǐng)域帶來(lái)了重要的技術(shù)突破，特別是在斜面顯微鏡（OPM）的遠(yuǎn)程焦點(diǎn)穩(wěn)定方面取得了顯著進(jìn)展。不僅為生物醫(yī)學(xué)研究中的長(zhǎng)時(shí)間觀察提供了更可靠的技術(shù)支持，也為未來(lái)光學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展提供了新的思路和方向。未來(lái)，通過(guò)引入更先進(jìn)的光學(xué)元件和控制算法，有望進(jìn)一步提高該技術(shù)的穩(wěn)定性和精度。該技術(shù)也有望與其他先進(jìn)的光學(xué)成像技術(shù)相結(jié)合，為生物醫(yī)學(xué)研究提供更全面、更高效的成像解決方案。

論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Nguyen TD, Rahmani A, Ponjavic A, Millett-Sikking A, Fiolka R. Active Remote Focus Stabilization in Oblique Plane Microscopy. bioRxiv [Preprint]. 2024 Dec 2:2024.11.29.626121. doi: 10.1101/2024.11.29.626121. Update in: Biomed Opt Express. 2025 Feb 26;16(3):1216-1224.

DOI:10.1364/BOE.553545.