高通量篩選平臺(tái)助肽—人類白細(xì)胞抗原pHLA靶向藥物安全評(píng)估
高通量篩選平臺(tái) ValidaTe 助力肽 - 人類白細(xì)胞抗原pHLA靶向藥物安全評(píng)估
--德國(guó)M2 點(diǎn)樣儀實(shí)現(xiàn)微腔芯片的高精準(zhǔn)加樣
--德國(guó)M2 點(diǎn)樣儀實(shí)現(xiàn)微腔芯片的高精準(zhǔn)加樣
T 細(xì)胞受體（T-cell receptor, TCR）療法、雙特異性 T 細(xì)胞銜接器（bispecific T-cell engagers, BiTE）等基于肽 - 人類白細(xì)胞抗原（peptide-human leukocyte antigen, pHLA）的免疫治療手段，已逐步在癌癥領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力，精準(zhǔn)評(píng)估藥物與 pHLA 的結(jié)合特異性成為臨床前安全評(píng)估的關(guān)鍵。然而，僅HLA-I類分子的免疫肽組約至少15 萬(wàn)種 pHLA 復(fù)合物，傳統(tǒng)技術(shù)如生物層干涉術(shù)（biolayer interferometry, BLI）、微陣列芯片SPR等，單次僅能最多檢測(cè)96種相互作用，通量低、耗時(shí)久，極大的脫靶風(fēng)險(xiǎn)。因此，開(kāi)發(fā)超高通量的篩選方法，對(duì)于確保 pHLA 靶向治療藥物的安全性和有效性，具有重要的臨床意義。
2023 年 3 月，BioCopy 公司聯(lián)合 Immatics Biotechnologies公司在《Scientific Reports》發(fā)表題為《An ultra-high-throughput screen for the evaluation of peptide HLA-Binder interactions》的文章。在該研究中，構(gòu)建了一種高通量篩選平臺(tái)ValidaTe，通過(guò)穩(wěn)定化 pHLA 分子、聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxan, PDMS）微腔芯片與單色反射干涉技術(shù)（highSCORE）的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì) TCR 與超 500 種 pHLA 復(fù)合物相互作用的大規(guī)模篩選分析。
實(shí)驗(yàn)方法如下：
實(shí)驗(yàn)方法如下：
1.肽庫(kù)制備與微腔芯片預(yù)處理
- 肽合成：制備 127 種多肽（含野生型及單氨基酸突變體），經(jīng)高效液相色譜HPLC純化后溶于二甲基亞砜（DMSO）/ 水（5%/95%），濃度 200 μg/ml。
- 微腔芯片（聚二甲基硅氧烷，PDMS 材質(zhì)）：使用M2-Automation 非接觸式皮升級(jí)／納升級(jí)點(diǎn)樣儀iOne，將 300 pl 肽溶液精準(zhǔn)點(diǎn)樣至 5k-PDMS 芯片的 5226 個(gè)微腔中（單個(gè)微腔體積 500 pL，直徑 150 μm，間距 50 μm）。（圖1）
- 干燥與存儲(chǔ)：室溫干燥后，芯片于 4℃保存，穩(wěn)定期可達(dá)數(shù)月。
2.pHLA 復(fù)合物和肽-pHLA微腔芯片
- pHLA 純化制備：表達(dá)含二硫鍵穩(wěn)定化修飾的人類白細(xì)胞抗原 A02:01（human leukocyte antigen A02:01, HLA-A*02:01）重鏈與 β2 微球蛋白（β2-microglobulin, β2m），體外復(fù)性后經(jīng)生物素化修飾（BirA 酶標(biāo)記），終濃度 200 μg/ml。
- 肽-pHLA-微腔芯片：通過(guò)M2-Automation 非接觸式皮升級(jí)／納升級(jí)點(diǎn)樣儀iOne，向含肽微腔中點(diǎn)樣 900 pl HLA 溶液。孵育后，pHLA 復(fù)合物通過(guò)生物素 - 鏈霉親和素（streptavidin, SA）相互作用，轉(zhuǎn)移至預(yù)活化的 3D 鏈霉親和素修飾玻璃片（highSCORE 芯片）。（圖1）
圖1肽-pHLA微腔芯片的實(shí)驗(yàn)流程圖
（1）不同的多肽被點(diǎn)樣至微腔芯片的獨(dú)立微腔中，（2）多肽溶液干燥，（3）陣列可長(zhǎng)期儲(chǔ)存（4）將生物素化的 HLA 分子點(diǎn)樣至各個(gè)微腔中發(fā)生復(fù)合物形成反應(yīng)，（5）復(fù)合物通過(guò)生物素 - 鏈霉親和素相互作用轉(zhuǎn)移至鏈霉親和素（SA）修飾的基底上，（6）用于不同分析物的無(wú)標(biāo)記分析，（7）結(jié)合曲線中確定動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
（1）不同的多肽被點(diǎn)樣至微腔芯片的獨(dú)立微腔中，（2）多肽溶液干燥，（3）陣列可長(zhǎng)期儲(chǔ)存（4）將生物素化的 HLA 分子點(diǎn)樣至各個(gè)微腔中發(fā)生復(fù)合物形成反應(yīng)，（5）復(fù)合物通過(guò)生物素 - 鏈霉親和素相互作用轉(zhuǎn)移至鏈霉親和素（SA）修飾的基底上，（6）用于不同分析物的無(wú)標(biāo)記分析，（7）結(jié)合曲線中確定動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
3.超高通量結(jié)合動(dòng)力學(xué)檢測(cè)
- 分析物制備：可溶性高親和力 TCR 分子梯度稀釋至 16-480 nM。
- highSCORE 檢測(cè)：將肽-pHLA 微腔芯片置于高通量反射干涉儀中，依次進(jìn)行基線校正（180 s）、結(jié)合（250-500 s）、解離（300-600 s）檢測(cè)，流速 2 μL/s，單次運(yùn)行生成 5226 條結(jié)合曲線。
- 數(shù)據(jù)擬合：采用 1:1 結(jié)合模型擬合動(dòng)力學(xué)參數(shù)（結(jié)合速率常數(shù)kass、解離速率常數(shù)kdiss、平衡解離常數(shù)KD），6 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)累計(jì)獲得超 3 萬(wàn)條有效曲線。
4.與傳統(tǒng)技術(shù)的對(duì)比驗(yàn)證
- BLI 對(duì)照實(shí)驗(yàn)：使用 Octet RED384 系統(tǒng)，檢測(cè)相同 pHLA-TCR 相互作用，對(duì)比發(fā)現(xiàn) ValidaTe 平臺(tái)數(shù)據(jù)集通量提升650 倍，且KD值相關(guān)性良好（R2>0.85），驗(yàn)證了新技術(shù)的準(zhǔn)確性。(圖2)
圖2 a） 從 highSCORE 和 BLI 測(cè)量獲得的KD值之間的相關(guān)性；BLI WTKD值顯示為藍(lán)色虛線，highSCORE WTKD表示為綠色虛線，箭頭突出顯示突出的點(diǎn)，灰色的點(diǎn)被排除在線性擬合之外。（b） highSCORE（綠色）和 BLI（藍(lán)色）測(cè)量的log10(KD)值的直方圖；BLI WTKD值顯示為藍(lán)色虛線，highSCORE WTKD表示為綠色虛線。
研究結(jié)論:
1.技術(shù)突破：ValidaTe 平臺(tái)通過(guò)微腔芯片與自動(dòng)化點(diǎn)樣技術(shù)（M2-Automation 非接觸式皮升級(jí)／納升級(jí)點(diǎn)樣儀iOne），解決了傳統(tǒng)微陣列中 pHLA 復(fù)合物穩(wěn)定性差、材料消耗高的難題，單次實(shí)驗(yàn)可處理超 500 種不同 pHLA 復(fù)合物，未來(lái)優(yōu)化后有望突破 1000 種。
2.效率革命：相較于 BLI 的單次 96 通量得到的數(shù)據(jù)集，ValidaTe 實(shí)現(xiàn)650 倍提升，結(jié)合曲線生成速度從小時(shí)級(jí)縮短至分鐘級(jí)，大幅降低時(shí)間與材料成本（單 spot 材料消耗僅為傳統(tǒng)方法的 1/1000）。
3.應(yīng)用價(jià)值：成功解析 TCR 與 pHLA 的結(jié)合特異性，定位關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，為藥物設(shè)計(jì)提供精準(zhǔn)靶點(diǎn)，推動(dòng)臨床前脫靶風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估進(jìn)入 “全譜篩查” 時(shí)代。
技術(shù)前景與展望
該平臺(tái)已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化服務(wù)（BioCopy），可定制化篩選多種 HLA 亞型及治療性分子（如 TCR 抗體、BiTE），適用于制藥企業(yè)、科研機(jī)構(gòu)的早期藥物開(kāi)發(fā)。未來(lái)計(jì)劃拓展至細(xì)胞水平檢測(cè)與復(fù)合物穩(wěn)定性分析，助力更多創(chuàng)新型免疫療法安全落地。
更多信息請(qǐng)參考原文：https://www.nature.com/articles/s41598-023-32384-z
M2-automation位于德國(guó)，專注于提供納升-皮升級(jí)超微量點(diǎn)樣生物芯片應(yīng)用領(lǐng)域的解決方案及服務(wù)。自公司成立即以來(lái)，20年始終致力于開(kāi)發(fā)高精度高靈活性生物樣品噴點(diǎn)液體處理平臺(tái)，
M2系列產(chǎn)品采用接觸式/非接觸式點(diǎn)樣技術(shù)，可輕松實(shí)現(xiàn)包括但不限于納米柱、微陣列、微針等各種標(biāo)準(zhǔn)化和個(gè)性化生物芯片制備，廣泛應(yīng)用于微流控、生物傳感器、臨床快檢（POCT）等領(lǐng)域。
環(huán)亞生物，生命科學(xué)產(chǎn)品全國(guó)性代理商，具備完善的公司運(yùn)營(yíng)、產(chǎn)品管理、營(yíng)銷、售前技術(shù)支持和售后維修體系。環(huán)亞生物作為M2-automation大中華區(qū)代理商，負(fù)責(zé)相關(guān)產(chǎn)品大中華區(qū)的營(yíng)銷和售后支持。
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環(huán)亞生物科技有限公司
地址：上海市松江區(qū)莘磚公路518號(hào)9幢502室
電話：021-54583565
郵箱：info@apgbio.com
網(wǎng)址：www.apgbio.com
1.技術(shù)突破：ValidaTe 平臺(tái)通過(guò)微腔芯片與自動(dòng)化點(diǎn)樣技術(shù)（M2-Automation 非接觸式皮升級(jí)／納升級(jí)點(diǎn)樣儀iOne），解決了傳統(tǒng)微陣列中 pHLA 復(fù)合物穩(wěn)定性差、材料消耗高的難題，單次實(shí)驗(yàn)可處理超 500 種不同 pHLA 復(fù)合物，未來(lái)優(yōu)化后有望突破 1000 種。
2.效率革命：相較于 BLI 的單次 96 通量得到的數(shù)據(jù)集，ValidaTe 實(shí)現(xiàn)650 倍提升，結(jié)合曲線生成速度從小時(shí)級(jí)縮短至分鐘級(jí)，大幅降低時(shí)間與材料成本（單 spot 材料消耗僅為傳統(tǒng)方法的 1/1000）。
3.應(yīng)用價(jià)值：成功解析 TCR 與 pHLA 的結(jié)合特異性，定位關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，為藥物設(shè)計(jì)提供精準(zhǔn)靶點(diǎn)，推動(dòng)臨床前脫靶風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估進(jìn)入 “全譜篩查” 時(shí)代。
技術(shù)前景與展望
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