聚焦聚集體去除：疏水層析在雙特異性抗體純化中的應(yīng)用

雙特異性抗體（bispecific antibodies, bsAbs）是人工工程化的免疫球蛋白，能夠同時(shí)識(shí)別同一抗原或不同抗原上的兩個(gè)表位。它們的雙重靶向能力使其比傳統(tǒng)單抗更具優(yōu)勢(shì)，在藥物治療中具有顯著前景。

首個(gè)雙抗產(chǎn)品于2009年獲批上市——卡妥索單抗（catumaxomab），靶向CD3與EpCAM，用于惡性腹水治療。雖然該藥于2013年退市，但此后雙抗研發(fā)迅猛發(fā)展。到2023年，全球已有超200種雙抗分子正在進(jìn)行300多項(xiàng)臨床試驗(yàn)，其中約75%針對(duì)實(shí)體瘤，25%針對(duì)血液惡性腫瘤。截至2024年底，已有19款雙抗藥物獲批上市。

從結(jié)構(gòu)上看，雙抗可分為不含F(xiàn)c區(qū)（Non IgG-like BsAb）與含F(xiàn)c區(qū)（IgG-like BsAb）。后者又細(xì)分為對(duì)稱(chēng)型與非對(duì)稱(chēng)型，其中非對(duì)稱(chēng)型包含四條不同鏈（兩種HC與兩種LC），極易出現(xiàn)鏈錯(cuò)配，產(chǎn)生大量副產(chǎn)物。即使通過(guò)工程手段（如knobs-into-holes、CrossMab）部分緩解錯(cuò)配，仍難完全消除。對(duì)稱(chēng)型雖副產(chǎn)物較少，但聚集體明顯增多，這可能是因?yàn)殒滈L(zhǎng)增加和柔韌性增強(qiáng)而導(dǎo)致的分子間結(jié)構(gòu)域交換形成的。因此，高效去除錯(cuò)配產(chǎn)物與聚集體等雜質(zhì)成為雙抗下游純化的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。

疏水相互作用層析（Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC）因其在抗體生產(chǎn)中能有效去除聚集體，廣泛應(yīng)用于下游工藝。

其原理為：根據(jù)蛋白表面疏水性差異，利用蛋白和疏水層析介質(zhì)疏水表面可逆的相互作用來(lái)分離蛋白。

結(jié)合-洗脫模式：選擇疏水性合適的的介質(zhì)，樣品中加入高鹽，蛋白結(jié)合，降低鹽濃度洗脫，分離目的蛋白和雜質(zhì)。

流穿模式：選擇具有高疏水性的介質(zhì)，不向樣品中加入鹽或者加入低鹽，目的蛋白流穿，雜質(zhì)結(jié)合。

以下為IgG4型雙抗（Fc區(qū)引入ScFv）的HIC優(yōu)化實(shí)驗(yàn)：Load SEC為85.6%，HCP 36 ppm

表1.優(yōu)化后疏水層析分離效果總結(jié)

Fig.1 己二醇和精氨酸洗脫梯度對(duì)疏水介質(zhì)的分離曲線(xiàn)的影響

己二醇、精氨酸能顯著提升純度與回收率�？赡艿脑�因在于己二醇、精氨酸可以改善溶液極性，降低疏水相互作用、穩(wěn)定蛋白構(gòu)象以及優(yōu)化洗脫動(dòng)力學(xué)，從而提高了介質(zhì)選擇性。但在實(shí)際應(yīng)用中需同時(shí)考慮添加劑的風(fēng)險(xiǎn)以及去除。從本實(shí)驗(yàn)可知，疏水層析也可通過(guò)簡(jiǎn)化疏水層析上樣條件，降低工藝復(fù)雜性。

疏水介質(zhì)選擇需綜合考慮配基的疏水性、配基的密度、介質(zhì)的基質(zhì)等；可依據(jù)如下表所示選擇合適疏水介質(zhì)

• 配基疏水性強(qiáng)弱：Butyl-S＜Butyl＜Octyl＜Phenyl

Fig.2 疏水層析介質(zhì)疏水性強(qiáng)弱順序表

• 粒徑影響分辨率：HP系列（34μm）＞Mustang系列（40μm）＞FF系列（90μm）

• 緩沖液種類(lèi)的選擇：正確選擇鹽的種類(lèi)和濃度是影響載量和選擇性的重要參數(shù)。最常用的鹽溶液是硫酸銨（2M以?xún)?nèi)，pH不高于8.0）、硫酸鈉、氯化鈉等。不同的鹽對(duì)蛋白與疏水介質(zhì)結(jié)合的影響如下順序：

Na₂SO₄ > (NH₄)₂SO₄ > NaCl > NH₄Cl > NaBr > NaSCN

• 離子強(qiáng)度的選擇：不同的離子強(qiáng)度表現(xiàn)出不同的選擇性，由于離子強(qiáng)度決定樣品的結(jié)合力，故隨著鹽濃度的增加，結(jié)合力增加，蛋白載量增加，但可能會(huì)導(dǎo)致蛋白結(jié)合太強(qiáng)或者蛋白沉淀，無(wú)法洗脫；而過(guò)低的鹽濃度會(huì)使蛋白無(wú)法結(jié)合。對(duì)于未知蛋白，初次實(shí)驗(yàn)推薦結(jié)合緩沖液：50mM PBS pH7.0，1-1.5M硫酸銨，洗脫緩沖液：50mM PBS pH7.0，可根據(jù)該次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，調(diào)整離子強(qiáng)度。

• 添加劑選擇：水溶性醇、去垢劑（改善溶液極性，減少水的表面張力，減弱相互作用導(dǎo)致蛋白解離，如己二醇、異丙醇等）、離序性鹽（降低溶液疏水效果，從而減弱疏水相互作用導(dǎo)致蛋白解離，如CaCl₂、MgCl₂）。

• 溫度控制：因疏水作用為熵驅(qū)動(dòng)，因而隨著溫度的升高，疏水相互作用增加，范德華力增加，從而導(dǎo)致蛋白結(jié)合變緊，故實(shí)驗(yàn)需謹(jǐn)慎控制溫度。

疏水層析作為雙抗純化中的關(guān)鍵步驟，在去除聚集體等方面展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。通過(guò)選擇合適的介質(zhì)類(lèi)型，優(yōu)化工藝參數(shù)，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子與雜質(zhì)的高效分離，實(shí)現(xiàn)高純度、高收率目標(biāo)，助力雙抗純化工藝產(chǎn)業(yè)化落地。

[1] Klein, Christian, et al. "The present and future of bispecific antibodies for cancer therapy." Nature reviews Drug discovery 23.4 (2024): 301-319.

[2] Li, Yifeng , et al. "A roadmap for IgG-like bispecific antibody purification." Approaches to the Purification, Analysis and Characterization of Antibody-Based Therapeutics (2020).

[3] Hall, Troii. , G. M. Kelly , and W. R. Emery . "Use of mobile phase additives for the elution of bispecific and monoclonal antibodies from phenyl based hydrophobic interaction chromatography resins." Journal of chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences 1096(2018):20-30.

[4] Chen, Serene W , and W. Zhang . "Current trends and challenges in the downstream purification of bispecific antibodies." Antibody Therapeutics 4.2(2021).

[5] Andrews, A. T. . "Protein purification principles, high resolution methods and applications." Food Chemistry (1991).