抗豬流行性腹瀉病毒N蛋白（PEDV-N）單克隆抗體解析及制備

抗豬流行性腹瀉病毒 N 蛋白（PEDV-N）單克隆抗體解析

一、PEDV-N 蛋白特性與抗原優(yōu)勢(shì)

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）屬于冠狀病毒科，其 N（核衣殼）蛋白是病毒最保守的結(jié)構(gòu)蛋白，具有以下特點(diǎn)：

結(jié)構(gòu)特征：

分子量約 46 kDa，由 415-432 個(gè)氨基酸組成，富含精氨酸和賴氨酸，親水性強(qiáng)。

含多個(gè)抗原表位，包括線性表位（如氨基酸殘基 100-150、200-250）和構(gòu)象表位，免疫原性高。

抗原優(yōu)勢(shì)：

保守性：不同 PEDV 毒株（如經(jīng)典株 CV777、變異株 AJ1102）的 N 蛋白氨基酸同源性＞95%，顯著高于 S 蛋白（同源性約 80%），適合制備廣譜抗體。

穩(wěn)定性：N 蛋白不參與病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合，不易因免疫壓力發(fā)生突變，抗體識(shí)別表位更穩(wěn)定。

二、PEDV-N 單克隆抗體制備關(guān)鍵流程

1. 抗原制備與免疫策略

重組 N 蛋白表達(dá)：

載體選擇：常用 pET 系列原核表達(dá)載體（如 pET-28a），在 BL21 (DE3) 大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，或使用桿狀病毒 - 昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)（真核表達(dá)，更接近天然構(gòu)象）。

純化方法：Ni-NTA 親和層析純化，純度需≥95%（SDS-PAGE 驗(yàn)證），抗原濃度調(diào)整至 1 mg/mL 用于免疫。

動(dòng)物免疫：

模型：6-8 周齡 BALB/c 小鼠，腹腔注射重組 N 蛋白（50 μg / 次）+ 弗氏完全佐劑（首次），后續(xù)用不完全佐劑加強(qiáng)免疫 3-4 次，間隔 2 周。

免疫監(jiān)測(cè)：末次免疫后 7 天采血，ELISA 檢測(cè)血清抗體效價(jià)，需≥1:10⁴方可進(jìn)行細(xì)胞融合。

2. 雜交瘤制備與篩選

細(xì)胞融合：

免疫小鼠脾細(xì)胞與 SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞按 5:1 比例混合，PEG1500 誘導(dǎo)融合，HAT 培養(yǎng)基篩選 7-10 天。

陽(yáng)性克隆篩選：

雙抗體夾心 ELISA：包被重組 N 蛋白，檢測(cè)雜交瘤培養(yǎng)上清中的抗體，篩選 OD 值＞2.1 倍陰性對(duì)照的克隆。

Western blot 驗(yàn)證：用 PEDV 感染的 Vero 細(xì)胞裂解液檢測(cè)抗體與天然 N 蛋白的結(jié)合活性。

毒株交叉反應(yīng)性測(cè)試：用經(jīng)典株（CV777）和變異株（AJ1102、DR13）的 N 蛋白驗(yàn)證抗體廣譜性。

3. 單克隆化與抗體生產(chǎn)

有限稀釋法：將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞稀釋至 0.5 細(xì)胞 / 孔，克隆化培養(yǎng) 2-3 輪，確保單克隆性。

抗體生產(chǎn)：

腹水制備：小鼠腹腔注射降植烷（0.5 mL / 只）預(yù)處理，7 天后注射雜交瘤細(xì)胞（1×10⁶/ 只），7-10 天收集腹水，抗體濃度可達(dá) 5-10 mg/mL。

細(xì)胞培養(yǎng)：無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，離心后通過(guò) Protein A/G 親和層析純化，抗體純度＞98%。

三、PEDV-N 單克隆抗體特異性參數(shù)

1. 抗原識(shí)別特性

表位定位：

通過(guò)肽段掃描（Peptide scanning）確定表位，常見(jiàn)高免疫原性區(qū)域包括：

氨基酸殘基 120-135（線性表位，經(jīng)典株與變異株高度保守）；

殘基 280-300（含 α- 螺旋結(jié)構(gòu)，構(gòu)象表位，部分抗體依賴此區(qū)域結(jié)合）。

交叉反應(yīng)性：

對(duì) PEDV 各基因型（如 G1a、G2a、G2b）毒株的 N 蛋白結(jié)合率＞95%，對(duì)豬德?tīng)査�冠狀病毒（PDCoV）、TGEV 等無(wú)交叉反應(yīng)（ELISA 驗(yàn)證）。

2. 功能活性參數(shù)

親和力（KD 值）：

高親和力抗體 KD 值＜10⁻⁹ M（BLI 或 SPR 檢測(cè)），典型值為 10⁻¹⁰-10⁻¹¹ M，確保檢測(cè)靈敏度。

應(yīng)用場(chǎng)景活性：

診斷：適用于雙抗體夾心 ELISA（檢測(cè)限可達(dá) 1 ng/mL PEDV 抗原）、免疫熒光（IFA）、膠體金試紙條（檢測(cè)時(shí)間＜15 分鐘）。

中和活性：N 蛋白抗體無(wú)病毒中和能力（因 N 蛋白不參與病毒入侵），中和抗體需針對(duì) S 蛋白。

3. 穩(wěn)定性與效期

保存條件：純化抗體用 PBS（pH 7.4）稀釋至 1 mg/mL，添加 0.02% 疊氮鈉，4℃保存 6 個(gè)月活性≥90%，-20℃可長(zhǎng)期保存。

批間一致性：不同批次抗體 ELISA 效價(jià)差異≤10%（CV 值＜10%），需通過(guò) 3 次獨(dú)立制備驗(yàn)證。

四、PEDV-N 抗體的應(yīng)用場(chǎng)景與優(yōu)勢(shì)

應(yīng)用類型 技術(shù)要點(diǎn) 優(yōu)勢(shì)

病原檢測(cè) - ELISA：包被抗體（10 μg/mL）+ 檢測(cè)抗體（5 μg/mL），標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍 0.1-100 ng/mL

- 膠體金試紙條：T 線包被 N 抗體，C 線包被羊抗鼠 IgG 對(duì)變異株檢測(cè)靈敏度高，不受 S 蛋白突變影響，適合流行病暴發(fā)期的快速篩查。

病毒定量 熒光定量 PCR 聯(lián)合 N 抗體免疫捕獲（RT-PCR-IP），提高低載量樣本檢出率（檢測(cè)限降至 10² 拷貝 /mL） 結(jié)合分子與免疫技術(shù)，減少核酸檢測(cè)假陰性。

疫苗評(píng)估 檢測(cè)免疫動(dòng)物血清中的 N 抗體水平，評(píng)估疫苗免疫原性（如滅活疫苗誘導(dǎo)的 N 抗體效價(jià)≥1:10³） N 抗體效價(jià)與病毒載量呈正相關(guān)，可作為疫苗保護(hù)力的輔助指標(biāo)。

基礎(chǔ)研究 免疫共沉淀（Co-IP）分析 N 蛋白與宿主蛋白（如 RIG-I、MDA5）的相互作用，或用于病毒樣顆粒（VLP）組裝研究 高特異性抗體可精準(zhǔn)識(shí)別天然 N 蛋白的結(jié)合伴侶。

五、制備與應(yīng)用注意事項(xiàng)

抗原構(gòu)象影響：真核表達(dá)的 N 蛋白（如昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)）比原核表達(dá)的包涵體蛋白更易誘導(dǎo)構(gòu)象表位抗體，建議優(yōu)先選擇真核表達(dá)系統(tǒng)。

檢測(cè)方法優(yōu)化：ELISA 檢測(cè)時(shí)需注意 N 蛋白的包被濃度（最佳 5-10 μg/mL）和封閉條件（5% 脫脂奶粉優(yōu)于 BSA），避免非特異性結(jié)合。

生物安全：使用 PEDV 活病毒進(jìn)行 IFA 或中和試驗(yàn)時(shí)，需在 BSL-2 實(shí)驗(yàn)室操作，滅活病毒需驗(yàn)證失活（56℃ 30 分鐘 + 核酸酶處理）。

如需開(kāi)發(fā)針對(duì) PEDV 的治療性抗體，需結(jié)合 S 蛋白抗體（中和活性）與 N 蛋白抗體（檢測(cè)輔助），形成聯(lián)合檢測(cè)或治療方案。