有蹄類原料-牛布魯氏菌BP26蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、純化效果驗(yàn)證與應(yīng)用

• 三維構(gòu)象：BP26 蛋白是牛布魯氏菌外膜的主要脂蛋白，屬于外膜蛋白（OMP）家族，其結(jié)構(gòu)特征如下： 
  • N 端信號肽：前 20-25 個氨基酸為脂蛋白信號肽（含保守的脂錨定位點(diǎn) Cys），經(jīng)翻譯后修飾連接脂質(zhì)分子，錨定于細(xì)菌外膜。
  • 核心結(jié)構(gòu)域：由 180-200 個氨基酸組成，形成 β- 桶狀跨膜結(jié)構(gòu)（含 8-10 個 β- 折疊），桶狀結(jié)構(gòu)內(nèi)側(cè)親水性氨基酸與周質(zhì)空間互作，外側(cè)疏水性氨基酸嵌入外膜脂質(zhì)雙層。
  • 表面暴露環(huán)：包含多個抗原性環(huán)區(qū)（如 Loop 3、Loop 5），暴露于細(xì)菌表面，是宿主免疫識別的主要區(qū)域。

• 原核表達(dá)結(jié)構(gòu)：重組表達(dá)時通常去除 N 端信號肽，僅保留成熟肽段（約 180 個氨基酸），以可溶性形式表達(dá)，其 β- 桶結(jié)構(gòu)可通過圓二色譜（CD）驗(yàn)證，β- 折疊含量約 45%-50%。

• 天然 BP26 蛋白：成熟肽段分子量約 26 kDa（因此得名 BP26），加上脂質(zhì)修飾后實(shí)際分子量約 28-30 kDa，SDS-PAGE 中遷移率略慢于理論值。
• 重組 BP26 蛋白：去除信號肽后理論分子量約 22-24 kDa（因不同菌株序列差異略有波動），無糖基化修飾，純化后 SDS-PAGE 顯示單一 24 kDa 條帶（與天然蛋白脂質(zhì)修飾前分子量一致）。

• 種屬特異性抗原：BP26 蛋白在牛布魯氏菌中高度保守，與羊布魯氏菌（B. melitensis）、豬布魯氏菌（B. suis）的同源蛋白有 60%-70% 序列相似性，可作為牛布魯氏菌的血清學(xué)診斷標(biāo)志物。
• 免疫反應(yīng)靶點(diǎn)：感染牛后，宿主產(chǎn)生的抗 BP26 抗體主要為 IgG，可通過 ELISA 或免疫印跡（WB）檢測，用于布魯氏菌病的輔助診斷。

• 熱穩(wěn)定性：BP26 蛋白的 β- 桶結(jié)構(gòu)使其具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，60℃處理 30 分鐘仍保留部分抗原活性，但 100℃煮沸會導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不可逆破壞。
• 外膜錨定功能：脂質(zhì)修飾的 N 端 Cys 殘基與外膜磷脂共價(jià)結(jié)合，維持細(xì)菌外膜完整性，參與布魯氏菌逃避免疫清除的機(jī)制（如抑制吞噬體 - 溶酶體融合）。

• BP26 蛋白表面抗原環(huán)區(qū)可發(fā)生抗原變異（如氨基酸突變或糖基化修飾），降低宿主抗體識別效率，是布魯氏菌慢性感染的致病機(jī)制之一。

根據(jù)重組 BP26 蛋白的表達(dá)系統(tǒng)及形式，常用純化方法如下：

• 表達(dá)形式：可溶性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)或周質(zhì)空間，少數(shù)情況下形成包涵體（需優(yōu)化誘導(dǎo)條件）。
• 純化流程： 
  • 破菌與分離：超聲破碎細(xì)菌，離心收集上清液（可溶性蛋白），周質(zhì)空間蛋白可通過滲透壓休克法釋放。
  • 親和層析（首選）： 
    • 融合 His-tag 時，使用 Ni-NTA 柱純化：平衡液（20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 10 mM 咪唑，pH 7.4）洗滌，250 mM 咪唑洗脫，純度可達(dá) 85%-90%。
    • 融合 GST-tag 時，用谷胱甘肽瓊脂糖樹脂純化，10 mM 還原型谷胱甘肽洗脫。
  • 凝膠過濾層析（精純）：通過 Superdex 75 柱去除聚合體或雜蛋白，進(jìn)一步提高純度至 95% 以上，同時驗(yàn)證蛋白單體狀態(tài)（洗脫峰對應(yīng) 24 kDa 分子量）。
  • 脫鹽與保存：透析至 PBS（pH 7.4），添加 50% 甘油（-20℃凍存）或 0.1% BSA（4℃短期保存），防止蛋白聚集。

• 分泌型表達(dá)優(yōu)勢：畢赤酵母或桿狀病毒 - 昆蟲細(xì)胞可實(shí)現(xiàn) BP26 蛋白的分泌表達(dá)，避免原核表達(dá)的內(nèi)毒素污染，適合制備診斷用高純度抗原。
• 純化步驟：培養(yǎng)上清經(jīng)離心、0.22 μm 濾膜過濾后，直接通過親和層析（同原核）或離子交換層析（利用 pI 約 8.0 的正電荷特性，通過 SP Sepharose 柱純化）。

• 若表達(dá)條件不佳導(dǎo)致包涵體形成，需用 6-8M 尿素溶解，Ni-NTA 柱純化后，通過梯度透析復(fù)性（添加 10 mM DTT 防止二硫鍵錯誤折疊），復(fù)性效率約 50%-60%，復(fù)性后需通過 ELISA 驗(yàn)證抗原活性。

• SDS-PAGE 與 WB 驗(yàn)證：純化后的 BP26 蛋白在 24 kDa 處顯影，且可與牛布魯氏菌陽性血清特異性結(jié)合（WB 條帶清晰）。
• ELISA 應(yīng)用：包被重組 BP26 蛋白（1-5 μg/mL）可檢測牛血清中的抗布魯氏菌抗體，與商業(yè)試劑盒（如 iELISA）的符合率達(dá) 90% 以上，適用于布魯氏菌病的現(xiàn)場篩查。
• 疫苗研究：BP26 蛋白與佐劑（如 Montanide）聯(lián)合免疫小鼠，可誘導(dǎo)產(chǎn)生 IFN-γ 和 IL-4，提示其兼具 Th1 和 Th2 型免疫應(yīng)答，是亞單位疫苗的候選抗原之一。

牛布魯氏菌 BP26 蛋白作為外膜脂蛋白，其保守的 β- 桶結(jié)構(gòu)和種屬特異性抗原性使其成為布魯氏菌病診斷與疫苗研發(fā)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。原核表達(dá)系統(tǒng)（大腸桿菌）因低成本和高表達(dá)量成為首選，配合親和層析和凝膠過濾可獲得高純度蛋白；真核系統(tǒng)（如酵母、昆蟲細(xì)胞）則可更好地模擬天然脂質(zhì)修飾，適用于結(jié)構(gòu)與免疫機(jī)制研究。純化后的 BP26 蛋白在血清學(xué)診斷（如 ELISA 試劑盒）和亞單位疫苗開發(fā)中具有重要應(yīng)用價(jià)值，為牛布魯氏菌病的防控提供了有效工具。