有蹄類(lèi)原料-牛疏螺旋體概述與主要蛋白類(lèi)型介紹

• 天然 OspA：成熟肽段理論分子量約 31-32 kDa，因脂質(zhì)修飾（N 端 Cys 連接脂肪酸）實(shí)際分子量約 34-36 kDa，SDS-PAGE 中遷移率略慢于理論值。
• 重組 OspA（無(wú)修飾）：去除信號(hào)肽后分子量約 29-30 kDa，純化后 SDS-PAGE 顯示單一 30 kDa 條帶。

• 階段特異性表達(dá)：OspA 在蜱媒介中高表達(dá)，幫助螺旋體在蜱腸上皮定植；感染宿主后，OspA 表達(dá)下調(diào)，被 OspC 等替代，形成免疫逃逸（抗原轉(zhuǎn)換機(jī)制）。
• 交叉反應(yīng)性：與其他疏螺旋體（如B. burgdorferi）的 OspA 有 40%-60% 序列同源性，可能導(dǎo)致血清學(xué)診斷的假陽(yáng)性。

• 蜱 - 宿主傳播媒介：OspA 與蜱腸細(xì)胞表面的脂蛋白受體（如 TROSPA）結(jié)合，是螺旋體在蜱體內(nèi)存活的關(guān)鍵因子。
• 抗血清殺傷作用：天然 OspA 可激活補(bǔ)體依賴(lài)的殺菌作用，但重組 OspA 因缺乏脂質(zhì)修飾，補(bǔ)體激活效率降低。

• 熱穩(wěn)定性較差：55℃處理 15 分鐘即開(kāi)始變性，需在 4℃或 - 20℃（添加甘油）保存；耐蛋白酶水解能力強(qiáng)（β- 桶結(jié)構(gòu)抵抗蛋白酶切割）。

• 可溶性表達(dá)純化流程： 
  • 誘導(dǎo)表達(dá)：IPTG（0.1-1 mM）誘導(dǎo) 4-6 小時(shí)，30℃低溫可提高可溶性表達(dá)（減少包涵體形成）。
  • 破菌與上清獲取：高壓均質(zhì)或超聲破碎，4℃離心（12,000×g）30 分鐘，收集上清液。
  • 親和層析（首選）： 
    • 融合 His-tag 時(shí)，使用 Ni-NTA 柱：平衡液（20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 10 mM 咪唑，pH 7.4）洗滌，250 mM 咪唑洗脫，純度達(dá) 80%-85%。
    • 融合 GST-tag 時(shí)，用谷胱甘肽瓊脂糖樹(shù)脂純化，10 mM 還原型谷胱甘肽洗脫。
  • 離子交換層析（精純）：利用 OspA 的 pI 約 6.5-7.0，通過(guò) Q Sepharose 柱（陰離子交換）在低鹽條件下結(jié)合，梯度 NaCl（0-1 M）洗脫，純度提升至 95%。
• 包涵體純化（若不可溶）： 
  • 8M 尿素溶解包涵體，Ni-NTA 柱純化后，通過(guò)梯度透析復(fù)性（添加 5% 甘油和 0.1 mM DTT 防止聚集），復(fù)性效率約 30%-40%，需 ELISA 驗(yàn)證抗原活性。

• 畢赤酵母分泌表達(dá)： 
  • 優(yōu)勢(shì)：可實(shí)現(xiàn) N 端脂質(zhì)修飾（模擬天然 OspA），抗原性更接近天然蛋白。
  • 純化：培養(yǎng)上清經(jīng)離心、0.22 μm 過(guò)濾后，通過(guò) Ni-NTA 親和層析或疏水層析（HiTrap Phenyl）純化，純度達(dá) 90% 以上，適用于疫苗研究。

• SDS-PAGE 與 WB：純化蛋白在 30 kDa 處顯影，與牛疏螺旋體陽(yáng)性血清特異性結(jié)合（WB 條帶清晰），與陰性血清無(wú)交叉反應(yīng)。
• ELISA 檢測(cè)：包被重組 OspA（5 μg/mL）可檢測(cè)牛血清中的特異性 IgG，與間接免疫熒光（IFA）的符合率達(dá) 85%，適用于蜱傳疏螺旋體病的現(xiàn)場(chǎng)篩查。

• 診斷試劑：重組 OspA 作為包被抗原，用于 ELISA 試劑盒檢測(cè)牛血清抗體，早期感染（蜱叮咬后 1-2 周）即可檢出，比傳統(tǒng)培養(yǎng)法更靈敏。
• 疫苗研發(fā)：OspA 疫苗在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，阻止蜱媒介傳播，但因天然抗原變異，需多表位嵌合設(shè)計(jì)以提高保護(hù)效力。
• 致病機(jī)制研究：通過(guò)重組 OspA 突變體（如 Loop 區(qū)點(diǎn)突變）研究其與蜱受體的結(jié)合機(jī)制，為阻斷傳播提供靶點(diǎn)。

• 由 350-380 個(gè)氨基酸組成，形成螺旋狀纖維結(jié)構(gòu)，分子量約 40-42 kDa，重組表達(dá)（大腸桿菌）時(shí)去除信號(hào)肽后約 38 kDa，SDS-PAGE 遷移率與理論值一致。

• 抗原性：FlaB 是保守抗原，不同疏螺旋體菌株間同源性＞70%，可作為屬特異性診斷抗原，但免疫原性較弱（Th1 型應(yīng)答為主）。
• 純化方式：同 OspA，采用 His-tag 親和層析 + 凝膠過(guò)濾（Superdex 200），純度可達(dá) 90%，適用于屬水平的血清學(xué)篩查（如區(qū)分疏螺旋體與其他螺旋體）。

牛疏螺旋體蛋白（如 OspA、FlaB）的結(jié)構(gòu)變異性和功能多樣性是其致病與傳播的關(guān)鍵。重組蛋白技術(shù)（尤以大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)為核心）通過(guò)優(yōu)化表達(dá)與純化工藝，可獲得高純度抗原，用于血清學(xué)診斷（如 ELISA）和疫苗研發(fā)。其中，OspA 因在蜱媒介中的關(guān)鍵作用成為阻斷傳播的重要靶點(diǎn)，而 FlaB 等保守蛋白則適用于屬水平的病原檢測(cè)。未來(lái)研究需關(guān)注抗原表位的多樣性與修飾機(jī)制，以提升診斷試劑的特異性和疫苗的保護(hù)效率。