活性氧 (ROS) 在各類疾病中的作用及其熒光檢測攻略

大家都曉得 ROS，活性氧嘛......但但但但但是，它可并非是一種單分子，而是一類總稱！那么，ROS 都包含哪些？當真集百害而無一利？與多種疾病相關(guān)的 ROS 又該如何檢測？？？

Section.01
活性氧 (ROS): 一類總稱

首先，大家所熟知的活性氧—— ROS，并不是單個分子的名稱，而是含氧原子的高反應性化合物的總稱！

如圖 1 所示，ROS 可以是中性分子，如 H₂O₂；離子，如超氧陰離子 O₂•^- ；或自由基，如羥基自由基•OH；當然也可以是單線態(tài)氧 ¹O₂ 。其中，羥基自由基•OH 為自由基，其余則為非自由基^[1]。不同 ROS 的形成升高導致分子損傷，稱為“氧化應激”。O₂•^- 由 O₂ 還原而成，是其他 ROS 的前體。例如，O₂•^- 分解形成 H₂O₂，H₂O₂ 與亞鐵化合物和相關(guān)還原劑發(fā)生 Fenton 反應或 Haber-Weiss 反應進一步還原為・OH^[2][3]。

圖 1. 活性氧 ROS 的電子式及轉(zhuǎn)換^[2][3]。 
A．活性氧的電子式。超氧陰離子 (O₂•^-)、過氧化氫 (H₂O₂)、羥基自由基 (•OH) 和單線態(tài)氧 (¹O₂) 的電子式 (從左上到右下)。圖中還顯示了分子氧的電子式以供比較。B. 活性氧反應性強，可迅速轉(zhuǎn)換。值得注意的是，超氧陰離子（O₂•^-）是不穩(wěn)定的，在超氧化物歧化酶（SOD）的作用下會迅速變成過氧化氫 (H₂O₂)。如果陰離子與一氧化氮 (NO) 反應，則形成過氧亞硝酸鹽 (ONOO^-)。單線態(tài)氧（¹O₂）可由次氯酸（HOCI）與 H₂O₂ 反應生成。

ROS：呼吸作用的副產(chǎn)物

ROS 由各種細胞區(qū)室產(chǎn)生，包括細胞質(zhì)、細胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和過氧化物酶體。在這些區(qū)室中，線粒體是 ROS 產(chǎn)生的主要貢獻者，它們產(chǎn)生了大約 90% 的細胞 ROS (圖 2)^[4][5]。在正常的氧代謝過程中，ATP 合成會產(chǎn)生 ROS。因此，在大多數(shù)情況下，ROS 被認為是呼吸作用的副產(chǎn)物。

除此之外，內(nèi)源性 ROS 產(chǎn)生的機制還包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和未折疊蛋白反應、過氧化物酶體的代謝反應、NADPH 氧化酶 2 系統(tǒng)和酶促反應等。當然，暴露于某些有害因素，如某些外源性藥物、感染因子、污染、紫外線、香煙煙霧和輻射，也可能導致 ROS 的產(chǎn)生。
 
圖 2. 線粒體活性氧 (ROS) 的主要來源^[5]。
線粒體呼吸鏈 (MRC) 由四種酶復合物 (I-IV) 組成。Krebs 循環(huán)中 NADH 和 FADH 2 提供的電子分別在復合物 I 和 II 處轉(zhuǎn)移，并依次轉(zhuǎn)移至復合物 III 和 IV。該電子轉(zhuǎn)移與跨內(nèi)膜的質(zhì)子轉(zhuǎn)運偶聯(lián)，產(chǎn)生質(zhì)子梯度，從而允許 ADP 通過 ATP 合酶（復合物 V）進行磷酸化。氧代謝產(chǎn)生超氧化物陰離子 (•0₂⁻ )，超氧化物歧化酶 (SOD) 將其轉(zhuǎn)化為過氧化氫 (H₂O₂)，然后在一些抗氧化酶防御機制（例如過氧化氫酶 (CAT) 或谷胱甘肽過氧化物酶 (GPx) 還原酶 (GPr) 系統(tǒng)）的作用下轉(zhuǎn)化為水。過量的 ROS 產(chǎn)生會氧化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或線粒體 DNA (mtDNA)，最終導致線粒體功能障礙和細胞死亡。

“雙刃劍”：ROS 的兩面性

你可能不了解 ROS，但你一定聽過護膚品的宣傳詞，什么抗老抗氧化，清除自由基，新升級自由基智感防御…… blabla~~

的確！過量 ROS 對身體大有害處。然鵝！在正常的細胞環(huán)境中，ROS 對生命至關(guān)重要。

一方面，ROS 具有高反應性，很容易與幾乎所有類型的生物分子發(fā)生反應。過量 ROS 通過氧化生物分子，如細胞膜脂質(zhì)、組織蛋白質(zhì)或酶、碳水化合物和 DNA 等引起氧化應激，導致細胞損傷。此外，ROS 可導致多種病理，癌癥、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病都顯示出 ROS 參與。另一方面，其參與不同的生物功能，低至中等濃度的 ROS 通過調(diào)節(jié)細胞信號級聯(lián)發(fā)揮作用。例如通過氧化還原調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)磷酸化、離子通道和轉(zhuǎn)錄因子。某些生物合成過程也需要 ROS，包括甲狀腺激素的產(chǎn)生和細胞外基質(zhì)的交聯(lián)等^[1][3]。此外，神經(jīng)傳遞、血小板聚集、血壓調(diào)節(jié)、免疫系統(tǒng)控制、學習和記憶、細胞生長調(diào)節(jié)、重要生物化合物的合成和外源代謝都與 ROS 有關(guān)。

表 1. 活性氧在各種疾病中的作用^[6]。
 
So！在 ROS 如此熱門的研究態(tài)勢下，更深入地了解其作用機制，便是重中之重。Buttttt，活性物質(zhì)嘛，總是難以檢測，譬如壽命很短，體內(nèi)存在的抗氧化劑種類繁多等。不過！結(jié)合使用合適的熒光探針，可是測量 ROS 的一種極好的方法。

Section.02
活性氧 (ROS): 檢測方案

本部分主要介紹 ROS 的熒光檢測方法！

不同種類的 ROS 應該選取哪種熒光探針？激發(fā)/發(fā)射波長、反應物誘導的熒光變化和主要應用都有哪些？如表 2 所示，小 M 為大家整理了 23 種熒光探針的相關(guān)信息（可登錄 MCE 官網(wǎng)、公眾號后臺私信或聯(lián)系銷售購買），大家點贊收藏，按需自取喔~

表 2. 不同熒光探針的 ROS 檢測方案^[1]。
 
超氧化物自由基（O₂•^-) 檢測

提到超氧化物 (O₂•^-)，就得先聊聊熒光探針 Dihydroethidium (DHE，又稱 Hydroethidine, HE, HY-D0079)！其主要檢測 O₂•^-。由于 O₂•^- 通常是占比最高的 ROS 成分，DHE 也被廣泛用于 ROS 的檢測。未氧化形式下，DHE 產(chǎn)生固有的藍色熒光 (Ex/Em=370/420 nm)，當 DHE 被 O₂ 氧化時，產(chǎn)生了一種熒光化合物乙錠 (E⁺)，可嵌入 DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，形成乙錠-DNA 復合物，產(chǎn)生紅色熒光^[1][7]。
 圖 3. Hydroethidine (HE) 和 ethidium (E⁺) 的化學結(jié)構(gòu)^[1]。
 

• DHE 實驗指南

實驗步驟^[7]

1. 溶液配制

（1）制備儲存液
用無水 DMSO 配制 10 mM 的 DHE 儲備液 (1mg DHE 溶于0.317 mL DMSO 中)。

（2）工作液的配置
用預熱好的無血清細胞培養(yǎng)基或 PBS 稀釋儲存液，配制成 1-10 μM 的 DHE 工作液（請根據(jù)實際情況調(diào)整 DHE 工作液的濃度）。

2. 細胞染色 (懸浮細胞)

（1）1000 g 離心 3-5 分鐘，棄上清。PBS 洗滌 2 次，每次 5 分鐘。
（2）加入 1 mL Dihydroethidium 工作液，室溫孵育 30 分鐘。
（3）4℃，400 g 離心 3-4 分鐘，棄上清。
（4）PBS 洗滌 2 次，每次 5 分鐘。
（5）用無血清細胞培養(yǎng)基或 PBS 重懸細胞，熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測。

3. 細胞染色 (貼壁細胞)

（1）將貼壁細胞培養(yǎng)于無菌蓋玻片上。
（2）從培養(yǎng)基中移出蓋玻片，吸除多余培養(yǎng)基。
（3）加入 100 μL 染料工作液，輕輕晃動使其完全覆蓋細胞，孵育 30 分鐘。
（4）吸去染料工作液，用培養(yǎng)基洗 2-3 次，每次 5 分鐘 ，使用熒光顯微鏡或流式細胞儀進行觀察（若需要用流式細胞儀檢測，需將細胞用胰蛋白酶消化重懸后再進行染色）。

實驗結(jié)果

圖 4A 為 DHE 細胞染色結(jié)果，檢測樣本為 U87 細胞,使用 DHE 5 μM 避光染色 30 min^[8]。 圖 4B-C 為 DHE 組織染色結(jié)果，圖 4B 檢測樣本為小鼠大腦冰凍切片,使用 DHE 10 μM 避光染色 1 h^[9]。圖 4C 檢測樣本為小鼠視網(wǎng)膜石蠟切片,使用 DHE 5 μM 避光染色 20 min，設置了超氧化物歧化酶處理組以驗證是否存在非特異干擾^[10]。
 


圖 4. DHE 細胞和組織染色結(jié)果^[8][9][10]。

熒光探針檢測 H₂O₂

如圖 5 所示，DCFH 氧化生成 DCF，一種熒光化合物，最初被認為是檢測H₂O₂ 的特定指示劑。然而，已經(jīng)證明 DCFH 可以被其他 ROS 氧化。DCFH-DA  (DCFH二乙酸形式, H2DCFH-DA, HY-D0940) 可以應用于細胞研究，因為它能夠通過細胞膜擴散，然后被細胞內(nèi)酯酶酶解成 DCFH。隨后，被多種 ROS 氧化 的 DCFH 生成綠色熒光的 DCF，被廣泛應用于總 ROS 的檢測^[1][11][12]。
 
圖 5. DCFH DA 脫酯化生成 DCFH，以及 ROS 和 RNS 進一步氧化生成熒光 DCF 的示意圖^[1]。
 

• H2DCFDA 實驗指南

實驗步驟^[7]

1. 溶液配制

（1） 制備儲存液
用無水 DMSO 配制 10 mM 的 H2DCFDA 儲備液 (5 mg 粉末加入 1.026 mL DMSO)。

（2）工作液的配制
用預熱好的無血清細胞培養(yǎng)基或 PBS 稀釋儲存液，配制成 1-10 μM 的 H2DCFDA 工作液（請根據(jù)實際情況調(diào)整 H2DCFDA 工作液濃度，且現(xiàn)用現(xiàn)配）。

2. 細胞染色 (懸浮細胞)

（1）1000 g 離心收集細胞，加入 PBS 洗滌兩次，每次 5 分鐘。
（2）加入 1 mL 染料工作液，室溫孵育 5-30 分鐘。
（3）400 g 離心 3-4 分鐘，棄去上清。
（4）加入 PBS 洗滌細胞兩次，每次 5 分鐘。
（5）用 1 mL 無血清培養(yǎng)基或 PBS 重懸細胞后，使用熒光顯微鏡或流式細胞儀進行觀察。

3. 細胞染色 (貼壁細胞)

（1）將貼壁細胞培養(yǎng)于無菌蓋玻片上。
（2）從培養(yǎng)基中移出蓋玻片，吸除多余培養(yǎng)基。
（3）加入 100 μL 染料工作液，輕輕晃動使其完全覆蓋細胞，孵育 5-30 分鐘。
（4）吸去染料工作液，用培養(yǎng)基洗 2-3 次，每次 5 分鐘 ，使用熒光顯微鏡或流式細胞儀進行觀察（若需要用流式細胞儀檢測，需將細胞用胰蛋白酶消化重懸后再進行染色）。

實驗結(jié)果

圖 6A 為 DHE 細胞染色結(jié)果，檢測樣本為 4T1 細胞，H2DCFDA 5 μM 避光染色 30 min^[13]。 圖 6B 為 DHE 組織染色結(jié)果，檢測樣本為活體海馬切片,使用 H2DCFDA 10 μM 避光染色 30 min^[14]。

圖 6. H2DCFDA 細胞和組織染色結(jié)果^[13][14]。

線粒體超氧化物（O₂•^-) 指示劑

線粒體有氧代謝是 ROS 的主要來源之一，不過也有少量 ROS 是NAD(P)H 氧化酶、細胞色素 P450 單加氧酶等產(chǎn)生的。在研究線粒體相關(guān)疾病機制，或評估線粒體靶向藥物效果時常需要聚焦于單獨的線粒體 ROS，這該如何是好？

莫慌， MitoSOX Red (HY-D1055) 就能夠避免其他來源 ROS 的干擾，直接反映線粒體的超氧化物生成狀態(tài)。MitoSOX Red 可以穿透細胞膜，通過線粒體膜電位依賴性的方式積聚在線粒體中，并被其中的超氧化物氧化，氧化產(chǎn)物與線粒體核酸結(jié)合發(fā)出強烈熒光 (Ex/Em=510/580 nm)^[15][16]。 
 

• MitoSOX Red 實驗指南

實驗步驟^[15][16]

1. 溶液配制

（1）制備儲存液
用無水 DMSO 配制 5 mM 的 MitoSOX Red 儲備液 (50 μg 粉末加入 13 μL DMSO)。

（2）工作液的配制
用預熱好的無血清細胞培養(yǎng)基或 PBS 稀釋儲存液，配制成 1-10 μM 的 MitoSOX Red 工作液（請根據(jù)實際情況調(diào)整 MitoSOX Red 工作液濃度，且現(xiàn)用現(xiàn)配）。

2. 細胞染色 (懸浮細胞)

（1）4℃ 1000 g 離心收集細胞，加入 PBS 洗滌兩次，每次 5 分鐘。細胞密度為 1×10⁶/mL。
（2）加入 1 mL 染料工作液，室溫孵育 5-30 分鐘。
（3）4℃ 400 g 離心 3-4 分鐘，棄去上清。
（4）加入 PBS 洗滌細胞兩次，每次 5 分鐘。
（5）用 1 mL 無血清培養(yǎng)基或 PBS 重懸細胞后，使用熒光顯微鏡或流式細胞儀進行觀察。

3. 細胞染色 (貼壁細胞)

（1）將貼壁細胞培養(yǎng)于無菌蓋玻片上。
（2）從培養(yǎng)基中移出蓋玻片，吸除多余培養(yǎng)基。
（3）加入 100 μL 染料工作液，輕輕晃動使其完全覆蓋細胞，孵育 5-30 分鐘。
（4）吸去染料工作液，用培養(yǎng)基洗 2-3 次，每次 5 分鐘 ，使用熒光顯微鏡或流式細胞儀進行觀察（若需要用流式細胞儀檢測，需將細胞用胰蛋白酶消化重懸后再進行染色）。

實驗結(jié)果

圖 7 為 MitoSOX Red 細胞染色結(jié)果，檢測樣本為 Huh7 細胞,使用 5 μM MitoSOX Red 避光染色 30 min^[17]。
 
圖 7. MitoSOX Red 細胞染色結(jié)果示例^[17]。

注意事項:

• 避光操作：DHE 儲存液、H2DCFDA 儲存液、MitoSOX Red 儲存液建議分裝后在 -20℃ 或 -80℃ 避光保存，避免反復凍融。同時，實驗全程也需要避光操作，溶解、孵育、洗滌和成像需要在暗環(huán)境中進行，必要時可用鋁箔等包裹樣品。
• 含核酸樣本：DHE 的熒光依賴于與核酸的結(jié)合，所以不能用于不含核酸的溶液樣本的 ROS 檢測。
• 及時觀察：H2DCFDA 和 MitoSOX Red 在染色后需要盡快觀察，并且染色后也不可固定細胞。
• 活細胞染色：H2DCFDA 和 MitoSOX Red 只適用于活細胞染色，DHE 推薦用于未固定的新鮮切片或活細胞（雖然 DHE 可以嘗試用于固定切片的染色，但是活細胞染色 DHE 后不可固定細胞）。
• 也有部分文獻將 DHE 用于石蠟切片，因為固定操作對 ROS 有一定的影響，固定時間、染色濃度等條件都需要根據(jù)實際樣本情況做調(diào)整，總體的染色效果往往也不如未固定的樣本，也有可能難以做出理想的效果，實在有固定切片染色需要的小伙伴可以參考上面圖 4 的組織染色示例摸索一下，并且建議設置超氧化物歧化酶處理組等實驗組來排除可能存在的非特異染色干擾~

產(chǎn)品推薦

HY-D0940，適合活細胞泛 ROS 檢測、綠色熒光通道觀測。

Dihydroethidium (DHE) HY-D0079，適合超氧化物檢測、紅色熒光通道觀測、有部分固定切片染色的文獻參考。

MitoSOX Red  HY-D1055，適合靶向線粒體的超氧化物檢測、橙紅色熒光通道觀測。

HKPerox-2  HY-D1157，適合活細胞內(nèi) H2O2 檢測的高靈敏度綠色熒光探針。

HKGreen-4I  HY-D1148，適合活細胞內(nèi) ONOO- 檢測的高靈敏度綠色熒光探針。

HKOH-1 HY-D1151，適合活細胞內(nèi) •OH 檢測的高靈敏度綠色熒光探針。

 

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