從“雙鏡打架”到“一鏡封神”：光片顯微鏡的"拆CP"革命

在生命科學(xué)研究中，傳統(tǒng)寬場(chǎng)顯微鏡和共聚焦顯微鏡已得到廣泛應(yīng)用，但存在光毒性高、成像速度慢等問(wèn)題。為了解決這些問(wèn)題，2004 年德國(guó) Stelzer 課題組[1]首次發(fā)明光片熒光顯微鏡（LSFM），它通過(guò)薄層光片選擇性照明樣品，創(chuàng)建一個(gè)與檢測(cè)軸正交的薄激發(fā)光片來(lái)照亮樣本的一個(gè)平面，從而減少了樣本的光暴露，降低了光漂白和光毒性的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)可實(shí)現(xiàn)高速三維成像^[2]，使針對(duì)活體的長(zhǎng)時(shí)間成像成為可能，成為胚胎發(fā)育、神經(jīng)科學(xué)和腫瘤等領(lǐng)域研究的重要工具。
 
然而，單一模態(tài)的光片顯微鏡不能適用于多種應(yīng)用場(chǎng)景，因此其模態(tài)歷經(jīng)了多次變化。從最初的正交雙物鏡和正置 V 形雙物鏡顯微鏡，到八字開(kāi)頂型雙物鏡顯微鏡，再到如今備受矚目的單物鏡光片顯微鏡，它的每一次進(jìn)化都在突破應(yīng)用和成像的極限。今天，我們就來(lái)聊聊光片顯微鏡的“變形記”。 
 
最早的光片顯微鏡采用“雙物鏡正交設(shè)計(jì)”——一個(gè)物鏡負(fù)責(zé)照明（生成光片），另一個(gè)垂直放置的物鏡負(fù)責(zé)成像，如圖a，多用于腦科學(xué)和神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域。  

為了提升易用性，研究者開(kāi)發(fā)了正置 V 形雙物鏡顯微鏡，通過(guò)傾斜光路適配5 mm 圓形載玻片，如圖b，多用于細(xì)胞樣本成像。
 
這種設(shè)計(jì)雖然簡(jiǎn)單，但問(wèn)題也很明顯：

1.橫向分辨率受限：高數(shù)值孔徑（NA）物鏡的工作距離短，但雙物鏡結(jié)構(gòu)要求照明物鏡有較長(zhǎng)工作距離，難以使用油鏡，因此只有低 NA 物鏡，能夠應(yīng)用于光片成像。（NA≤1.1，對(duì)應(yīng)分辨率約 300 nm）。

2. 無(wú)法適配常規(guī)載具：操作空間受限，傳統(tǒng)正交物鏡的樣品必須懸空固定，無(wú)法使用常規(guī)載玻片或培養(yǎng)皿。正置 V 形雙物鏡的載具只能是 5 mm 圓形薄玻片，常規(guī)載玻片、培養(yǎng)皿和孔板不能適配。

3. 應(yīng)用場(chǎng)景單一：無(wú)法滿足多尺度、多類型樣本的成像需求。例如，單臺(tái)儀器僅能適配特定尺寸或固定形態(tài)的樣本，難以覆蓋從亞細(xì)胞到組織水平的多尺度觀測(cè)需求。

雖然第一代光片顯微鏡相對(duì)于共聚焦顯微鏡光毒性低，成像通量高，但其分辨率及易用性受限，且無(wú)法適配常規(guī)載具。
 
為了解決第一代光片顯微鏡無(wú)法適配常規(guī)載具，學(xué)習(xí)和使用成本高的問(wèn)題，開(kāi)發(fā)者開(kāi)發(fā)了八字開(kāi)頂型雙物鏡--倒置光片顯微鏡，讓樣品放置更符合常規(guī)實(shí)驗(yàn)習(xí)慣。

倒置配置是標(biāo)準(zhǔn)樣品載具可用于高分辨率顯微技術(shù)的重要先決條件，該配置帶來(lái)的弊端主要是成像會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)的畸變，因?yàn)闊晒鈴臉悠分邪l(fā)射，經(jīng)過(guò)水相細(xì)胞培養(yǎng)基、傾斜的玻璃蓋玻片和水介質(zhì)，然后進(jìn)入檢測(cè)物鏡。為了解決熒光信號(hào)畸變的問(wèn)題，開(kāi)發(fā)者添加了光學(xué)元件在兩個(gè)倒置物鏡的光路上，但是由于較長(zhǎng)工作距離，以及調(diào)整畸變的光學(xué)元件的增加，使得分辨率受限。
這種設(shè)計(jì)還存在以下問(wèn)題：

1.橫向分辨率受限：倒置雙物鏡結(jié)構(gòu)要求照明物鏡有較長(zhǎng)工作距離，只能選擇低 NA 物鏡（NA≤1.0，對(duì)應(yīng)分辨率約 330 nm），導(dǎo)致分辨率受限。

2.固定倍率：無(wú)法靈活切換物鏡倍率，需專業(yè)的光學(xué)工程師手動(dòng)切換。

3.應(yīng)用場(chǎng)景受限：無(wú)法滿足多尺度、多類型樣本的成像需求。由于物鏡擺放方式犧牲了大部分工作距離（WD），導(dǎo)致實(shí)際工作距離很短（如圖所示），因此成像深度低，通常小于 200 µm，厚度較大的樣本無(wú)法適用。且平臺(tái)維護(hù)成本高。
 
為了解決高 NA 物鏡（油鏡）無(wú)法使用的問(wèn)題，研究者們開(kāi)發(fā)了斜平面顯微鏡（OPM），并提升了光片性能，費(fèi)鵬教授團(tuán)隊(duì)研發(fā)的高通量貝塞爾斜平面顯微鏡（HBOPM）^[7] ，通過(guò)單物鏡斜照明光路設(shè)計(jì)，將照明與檢測(cè)光路整合至同一高 NA 物鏡（NA 1.3 硅油鏡），實(shí)現(xiàn)油鏡在光片成像中的應(yīng)用，進(jìn)一步突破了光片顯微鏡的分辨率極限，達(dá)到亞細(xì)胞級(jí)分辨率。且為倒置開(kāi)頂式設(shè)計(jì)，可以兼容多種常規(guī)載具。

1.無(wú)法切換倍率：由于光路中 O1 物鏡和用于傾斜矯正的 O2、O3 物鏡需要精密對(duì)齊，僅更換一級(jí)探測(cè)物鏡不能實(shí)現(xiàn)倍率切換，而是需要更換全部物鏡，重建整個(gè)光路，因此變倍問(wèn)題仍需后續(xù)技術(shù)優(yōu)化。

2.廣泛使用受限：該成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，組裝、校準(zhǔn)、維護(hù)困難，非專業(yè)光學(xué)實(shí)驗(yàn)室難以維護(hù)。
   
第一代正交雙物鏡光片顯微鏡相對(duì)于共聚焦顯微鏡光毒性低，成像通量高，但其分辨率及易用性受限，操作復(fù)雜，學(xué)習(xí)成本高，使用場(chǎng)景單一。

第二代倒置雙物鏡解決了載具兼容性問(wèn)題，但引入了熒光信號(hào)畸變的問(wèn)題，犧牲了分辨率和實(shí)際成像距離（小于 200 μm），并且固定倍率，使用場(chǎng)景受限。

第三代單物鏡進(jìn)一步突破，解決了高 NA 物鏡（油鏡）無(wú)法使用的問(wèn)題，提升了分辨率，但面臨無(wú)法變換物鏡倍率的限制，并且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，維護(hù)困難，導(dǎo)致廣泛使用受限。
 
費(fèi)鵬教授團(tuán)隊(duì)研發(fā)的 SmartView 顯微系統(tǒng)采用單物鏡光路設(shè)計(jì)^[3]，超景深共焦探測(cè)，實(shí)現(xiàn)了片掃共聚焦，兼具共聚焦的操作習(xí)慣和光片的成像優(yōu)勢(shì)，顛覆了傳統(tǒng)光片顯微鏡的使用局限。一方面，可以具有開(kāi)放式的樣本操作空間，使其不再需要特制樣本載具，適用于共聚焦培養(yǎng)皿、多孔板、類器官芯片、載玻片等標(biāo)準(zhǔn)載具；另一方面，可以實(shí)現(xiàn)物鏡倍率的靈活切換（4 ×-100 ×），可適配油鏡。從亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)到活細(xì)胞，從類器官到全器官，SmartView 能滿足不同應(yīng)用場(chǎng)景的需求。結(jié)合光片顯微鏡光毒性低的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞的精細(xì)動(dòng)態(tài)和相互作用進(jìn)行快速、三維、長(zhǎng)時(shí)程地觀測(cè)。使得光片顯微鏡的優(yōu)勢(shì)能夠最大的發(fā)揮出來(lái)。

傳統(tǒng)的光片顯微鏡成像受限于奈奎斯特采樣定律，面臨樣本健康、時(shí)間分辨率、空間分辨率以及視場(chǎng)范圍之間的權(quán)衡[9]。為了克服這些限制，SmartView 智能光片顯微鏡引入了智能成像方案、基于AI的高效圖像處理算法和大數(shù)據(jù)處理與分析技術(shù)進(jìn)一步提升生物圖像的準(zhǔn)確性和信息量。結(jié)合先進(jìn)算法，光片顯微技術(shù)可實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的病理切片三維重建和圖像分析，為疾病診斷和治療方案制定提供了更科學(xué)的依據(jù)^[10]。
📜 SmartView 核心技術(shù)優(yōu)勢(shì)解析

🔬 高 NA 單物鏡光片
目前已報(bào)道的單物鏡光片顯微鏡的最高實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證數(shù)值孔徑（NA）為1.35[11]，SmartView 顯微系統(tǒng)的數(shù)值孔徑（NA）高達(dá)1.5（油浸物鏡），橫向分辨率達(dá) 220 nm。

💡 超薄無(wú)衍射光片
使用多重調(diào)制超薄無(wú)衍射照明光片[3]，最薄400 nm，使用這種新型光片可幾乎消除旁瓣干擾，保證高軸向分辨率。

🛠 跨尺度聯(lián)合成像
可自由變倍（4 ×-100 ×），無(wú)縫銜接亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀測(cè)與全器官三維重建，覆蓋從微觀到宏觀的全尺度研究需求（亞細(xì)胞→組織）。

🎯 全流程解決方案
提供從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、熒光染色到成像分析的全流程解決方案，包括方案優(yōu)化、多色標(biāo)記指導(dǎo)和高端成像支持，確保高質(zhì)量數(shù)據(jù)產(chǎn)出，技術(shù)團(tuán)隊(duì)全程護(hù)航。
 
真正實(shí)現(xiàn)了"高分辨+低光毒+全兼容"三位一體：

✓ 高 NA1.5 油鏡
✓ 兼容標(biāo)準(zhǔn)載具
✓ 靈活變倍（4 ×-100 ×）全尺度聯(lián)合成像（亞細(xì)胞→組織）
 
參考文獻(xiàn)： 

[1] Huisken J, Swoger J, Del Bene F, et al. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy[J]. Science, 2004, 305(5686): 1007-1009.

[2] 周瑤, 費(fèi)鵬. 《光片熒光顯微成像技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用》, 激光與光電子學(xué)進(jìn)展, 2024.

[3] Zhao Y, Zhang M, Zhang W, Zhou Y, Chen L, Liu Q, Wang P, Chen R, Duan X, Chen F, Deng H, Wei Y, Fei P, Zhang YH. Isotropic super-resolution light-sheet microscopy of dynamic intracellular structures at subsecond timescales. Nat Methods. 2022 Mar;19(3):359-369. 

[4] Fang C, Yu T, Chu T, Feng W, Zhao F, Wang X, Huang Y, Li Y, Wan P, Mei W, Zhu D, Fei P. Minutes-timescale 3D isotropic imaging of entire organs at subcellular resolution by content-aware compressed-sensing light-sheet microscopy. Nat Commun. 2021 Jan 4;12(1):107.

[5] Wang Z, Zhu L, Zhang H, Li G, Yi C, Li Y, Yang Y, Ding Y, Zhen M, Gao S, Hsiai TK, Fei P. Real-time volumetric reconstruction of biological dynamics with light-field microscopy and deep learning. Nat Methods. 2021 May;18(5):551-556. 

[6] Goda K, Lu H, Fei P, Guck J. Revolutionizing microfluidics with artificial intelligence: a new dawn for lab-on-a-chip technologies. Lab Chip. 2023 Aug 22;23(17):3737-3740. 

[7]Wang Z, Wang J, Zhao Y, Jin J, Si W, Chen L, Zhang M, Zhou Y, Mao S, Zheng C, Zhang Y, Chen L, Fei P. 3D live imaging and phenotyping of CAR-T cell mediated-cytotoxicity using high-throughput Bessel oblique plane microscopy. Nat Commun. 2024 Aug 6;15(1):6677. 

[8] Wang, Z., Wang, J., Zhao, Y. et al. 3D live imaging and phenotyping of CAR-T cell mediated-cytotoxicity using high-throughput Bessel oblique plane microscopy. Nat Commun 15, 6677 (2024). 

[9] 馬異凡，費(fèi)鵬. 人工智能驅(qū)動(dòng)的光片熒光顯微成像技術(shù)（特邀）[J]. 中國(guó)激光，2025，52(9): 0907101.

[10] 費(fèi)鵬, 思文天, 張敏超. 基于光片熒光顯微鏡的三維病理分析綜述（特邀）[J]. 光學(xué)學(xué)報(bào)（網(wǎng)絡(luò)版）, 2024, 1(5): 0516002. 

[11]Etai Sapoznik, Bo-Jui Chang, et al. (2020) A versatile oblique plane microscope for large-scale and high-resolution imaging of subcellular dynamics. eLife 9:e57681.