豬偽狂犬病毒（PRV）gE 蛋白的結(jié)構(gòu)、功能與研究應(yīng)用解析

PRV gE 蛋白（糖蛋白 E，Glycoprotein E）由病毒基因組 UL44 基因編碼，具有以下特點(diǎn)：

• 全長(zhǎng)序列：約 530-550 個(gè)氨基酸，含 N 端信號(hào)肽（18-22 個(gè)氨基酸）、胞外區(qū)（約 470 個(gè)氨基酸）、跨膜區(qū)（22 個(gè)氨基酸）和胞內(nèi)尾（30-40 個(gè)氨基酸）；
• 保守結(jié)構(gòu)域：胞外區(qū)含 6 個(gè)保守半胱氨酸殘基（形成 3 對(duì)二硫鍵），C 端含免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM），參與病毒胞內(nèi)運(yùn)輸。

• 三維構(gòu)象：gE 以同源二聚體形式存在于病毒包膜，電鏡下呈 “Y 型”，胞外區(qū)由 β 折疊和 α 螺旋交替形成核心支架；
• 糖基化位點(diǎn)：含 8-10 個(gè) N - 糖基化位點(diǎn)（如 Asn150、Asn280、Asn400），糖基化程度影響病毒感染力和免疫逃逸能力；
• 變異株差異：近年流行的 PRV 變異株（如 China 2012-like 株）在胞外區(qū)新增 2 個(gè)糖基化位點(diǎn)（Asn350、Asn450），可能增強(qiáng)其致病性。

• 理論分子量：未糖基化的 gE 多肽鏈約 60 kDa；
• 天然狀態(tài)分子量：因高度糖基化，PRV 野毒株 gE 在 SDS-PAGE 中遷移至 90-110 kDa，疫苗株（如 Bartha-K61）gE 約 85 kDa；
• 表達(dá)定位：gE 是 PRV 的晚期蛋白（感染后 12-24 h 高表達(dá)），主要定位于病毒包膜、宿主細(xì)胞膜及高爾基體，參與病毒出芽和細(xì)胞間傳播。

• 宿主受體結(jié)合：gE 可與宿主細(xì)胞表面的糖胺聚糖（GAGs）結(jié)合，輔助 gD/gB/gH/gL 復(fù)合物介導(dǎo)病毒與細(xì)胞膜融合；
• 細(xì)胞間傳播：gE 與 gI 蛋白形成復(fù)合物（gE/gI），通過 “順行運(yùn)輸” 機(jī)制促進(jìn)病毒在神經(jīng)元突觸間擴(kuò)散，是 PRV 嗜神經(jīng)性的決定因素之一。

• 抑制宿主免疫應(yīng)答：gE 可下調(diào)宿主細(xì)胞 MHC I 類分子表達(dá)，減少 CTL 細(xì)胞對(duì)感染細(xì)胞的識(shí)別；
• 毒力相關(guān)性：敲除 gE 基因的 PRV 變異株（如缺失株 SA215）毒力顯著減弱，常用于基因缺失疫苗研發(fā)。

• 構(gòu)建 pFastBac 載體（含 gE 胞外區(qū)基因 + His 標(biāo)簽），轉(zhuǎn)染 Sf9 細(xì)胞后感染重組桿狀病毒，27℃培養(yǎng) 72 h；
• 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清（分泌型 gE）或超聲破碎細(xì)胞（胞內(nèi) gE），4℃離心（12000×g，30 min）取上清。

1. Ni-NTA 柱純化

   • 平衡液：50 mM Tris-HCl（pH 8.0）+ 150 mM NaCl + 10 mM 咪唑；
   • 洗脫液：含 250 mM 咪唑的平衡液，收集洗脫峰組分；
   • 脫鹽：PD-10 柱更換為 PBS（pH 7.4）。

2. 離子交換層析（IEX）

   • 進(jìn)一步去除雜蛋白：使用 Q Sepharose 柱（陰離子交換），梯度 NaCl（0-1 M）洗脫，收集 gE 組分（純度≥95%）。

• 若 gE 在大腸桿菌中形成包涵體：
  1. 6 M 鹽酸胍溶解包涵體，離心取上清；
  2. 透析復(fù)性（含 10% 甘油 + 0.5 mM 氧化谷胱甘肽），超濾濃縮至 1-2 mg/mL。

• gE-ELISA 檢測(cè)方法： 
  • 原理：PRV 野毒株感染豬會(huì)產(chǎn)生抗 gE 抗體，而 Bartha-K61 等疫苗株因 gE 基因缺失（ΔUL44）不表達(dá) gE，可通過檢測(cè) gE 抗體區(qū)分野毒感染與疫苗免疫；
  • 應(yīng)用：歐盟標(biāo)準(zhǔn)診斷方法（如 cELISA）以純化 gE 為包被抗原，特異性達(dá) 98% 以上。

• gE/gI 雙缺失疫苗：如國(guó)內(nèi)研發(fā)的 PRV TJ-gE⁻/gI⁻株疫苗，刪除 gE/gI 基因后毒力減弱，但保留 gB/gD 等免疫原性蛋白，免疫豬可產(chǎn)生高效中和抗體（滴度≥1:2000），且不干擾 gE 抗體檢測(cè)；
• 反向遺傳技術(shù)改造：通過同源重組刪除 gE 基因，結(jié)合 gB/gD 抗原優(yōu)化，開發(fā)多價(jià)亞單位疫苗。

1. 糖基化異質(zhì)性挑戰(zhàn)

• 問題：不同表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的 gE 糖鏈結(jié)構(gòu)差異大（如昆蟲細(xì)胞高甘露糖型、哺乳動(dòng)物細(xì)胞復(fù)雜型），影響診斷抗體識(shí)別；
• 解決方案：采用糖基化缺陷型細(xì)胞系（如 HEK293 GnTI⁻細(xì)胞）表達(dá) gE，獲得均一糖鏈結(jié)構(gòu)，或通過酶法去除天然糖鏈后重修飾。

2. gE/gI 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解析

• 冷凍電鏡（Cryo-EM）研究顯示，gE/gI 復(fù)合物通過 DⅠ 區(qū)形成 “鉗狀” 結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)病毒在神經(jīng)元間的順行運(yùn)輸，靶向該復(fù)合物的單克隆抗體可阻斷病毒擴(kuò)散（中和效價(jià) IC₅₀=10 ng/mL）；
• 基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)：開發(fā)小分子抑制劑結(jié)合 gE/gI 界面，抑制病毒細(xì)胞間傳播。

PRV gE 蛋白因其在病毒致病性和免疫逃逸中的關(guān)鍵作用，成為診斷與疫苗研發(fā)的核心靶點(diǎn)。純化 gE 時(shí)需根據(jù)應(yīng)用場(chǎng)景選擇表達(dá)系統(tǒng)：診斷用抗原優(yōu)先原核表達(dá)（成本低），疫苗抗原需真核表達(dá)（糖基化天然）。未來，結(jié)合結(jié)構(gòu)生物學(xué)（如 gE/gI 復(fù)合物與宿主受體的互作機(jī)制）和基因編輯技術(shù)，可進(jìn)一步開發(fā)高效鑒別診斷試劑和廣譜疫苗。如需特定毒株（如 HB1、AJ 株）gE 的序列分析或純化優(yōu)化，可提供毒株信息進(jìn)行定制化方案設(shè)計(jì)。