犬紅細(xì)胞單克隆抗體基礎(chǔ)特性、制備流程與應(yīng)用領(lǐng)域

瀏覽次數(shù)：74　發(fā)布日期：2025-7-1　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

犬紅細(xì)胞單克隆抗體（Canine Red Blood Cell Monoclonal Antibody，cRBC-McAb）是針對(duì)犬紅細(xì)胞（canine Red Blood Cell，cRBC）表面特異性抗原制備的單克隆抗體，憑借其特異性強(qiáng)、均一性高等特點(diǎn)，在犬類疾病診斷、免疫學(xué)研究及獸醫(yī)臨床中具有重要應(yīng)用價(jià)值。以下從基礎(chǔ)特性、制備流程、應(yīng)用領(lǐng)域等方面詳細(xì)介紹：

一、犬紅細(xì)胞（cRBC）與 cRBC-McAb 的基礎(chǔ)特性

犬紅細(xì)胞的抗原特征：犬紅細(xì)胞表面存在多種獨(dú)特抗原，包括血型抗原（如犬常見的 DEA 1.1、DEA 1.2、DEA 3、DEA 4 等血型系統(tǒng)抗原）、膜蛋白抗原（如帶 3 蛋白、血型糖蛋白）及糖脂類抗原等。其中，血型抗原是引發(fā)犬輸血反應(yīng)的關(guān)鍵因素（如 DEA 1.1 陽性血輸給陰性犬可能導(dǎo)致溶血），也是 cRBC-McAb 的重要靶向?qū)ο蟆?/span>
cRBC-McAb 的核心特性：由單一 B 淋巴細(xì)胞克隆分泌，僅識(shí)別 cRBC 表面的特定抗原表位，具有特異性強(qiáng)（可精準(zhǔn)區(qū)分不同血型或抗原亞型）、批次穩(wěn)定性高（克服多克隆抗體成分復(fù)雜、差異大的問題）、可規(guī)模化制備等優(yōu)勢(shì)，為犬紅細(xì)胞相關(guān)研究和應(yīng)用提供了標(biāo)準(zhǔn)化工具。

二、cRBC-McAb 的制備流程

免疫原制備與動(dòng)物免疫：
- 免疫原：采集健康犬的新鮮抗凝血，通過生理鹽水或 PBS 反復(fù)洗滌（去除血漿蛋白、白細(xì)胞等雜質(zhì)），獲得純化的犬紅細(xì)胞懸液（濃度通常為 1-5%）。
- 免疫動(dòng)物：常用 Balb/c 小鼠，通過腹腔或靜脈注射進(jìn)行免疫。為增強(qiáng)免疫應(yīng)答，可采用 “初次免疫 + 多次加強(qiáng)免疫” 策略（間隔 1-2 周），最后一次免疫后 3-5 天取脾臟細(xì)胞，用于后續(xù)細(xì)胞融合。
細(xì)胞融合與雜交瘤篩選：
- 融合步驟：將免疫小鼠的脾臟 B 淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞（如 SP2/0）通過聚乙二醇（PEG）或電融合技術(shù)融合，形成雜交瘤細(xì)胞。
- 篩選培養(yǎng)：利用 HAT 選擇培養(yǎng)基（含次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶）篩選存活的雜交瘤細(xì)胞（未融合的骨髓瘤細(xì)胞和 B 淋巴細(xì)胞因代謝缺陷無法存活）。
陽性克隆鑒定與克隆化：
- 鑒定方法：通過間接血凝試驗(yàn)（IHA）檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清液與 cRBC 的特異性結(jié)合（若產(chǎn)生凝集反應(yīng)則為陽性）；或采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）更精準(zhǔn)地驗(yàn)證抗體與 cRBC 表面抗原的結(jié)合能力（標(biāo)記熒光二抗后檢測(cè)熒光信號(hào)）。
- 克隆化培養(yǎng)：對(duì)陽性雜交瘤細(xì)胞通過有限稀釋法或單細(xì)胞克隆技術(shù)進(jìn)行多次克隆，確保獲得能穩(wěn)定分泌目標(biāo)抗體的單克隆細(xì)胞株。
抗體生產(chǎn)與純化：
- 小規(guī)模生產(chǎn)：將雜交瘤細(xì)胞腹腔注射到 Balb/c 小鼠（預(yù)先注射降植烷），收集腹水，經(jīng)離心、飽和硫酸銨鹽析或蛋白 A/G 親和層析純化，獲得高純度抗體。
- 大規(guī)模生產(chǎn)：利用生物反應(yīng)器體外培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從培養(yǎng)液中純化抗體，適用于工業(yè)化試劑盒生產(chǎn)。

三、主要應(yīng)用領(lǐng)域

犬血型鑒定與輸血安全：
- 犬血型系統(tǒng)復(fù)雜（已發(fā)現(xiàn) 13 種血型抗原，以 DEA 1.1 最為重要），輸血前需匹配血型，否則可能引發(fā)溶血性輸血反應(yīng)。cRBC-McAb（如抗 DEA 1.1 單克隆抗體）可通過凝集試驗(yàn)快速鑒定犬血型（如 DEA 1.1 陽性 / 陰性），確保輸血安全。
- 應(yīng)用示例：將待檢犬紅細(xì)胞與抗 DEA 1.1 McAb 反應(yīng)，若出現(xiàn)凝集，說明該犬為 DEA 1.1 陽性，需選擇同型血源。
犬免疫介導(dǎo)性溶血性貧血（IMHA）的診斷：
- IMHA 是犬常見的自身免疫性疾病，患病犬體內(nèi)產(chǎn)生抗自身紅細(xì)胞的抗體（自身抗體），導(dǎo)致紅細(xì)胞破壞。cRBC-McAb 可作為特異性試劑，通過直接抗球蛋白試驗(yàn)（DAT，即 Coomb’s 試驗(yàn)）檢測(cè)紅細(xì)胞表面吸附的自身抗體：將 cRBC-McAb 與待檢紅細(xì)胞孵育，若出現(xiàn)凝集，提示存在自身抗體，輔助確診 IMHA。
獸醫(yī)免疫學(xué)研究：
- 作為工具抗體研究犬紅細(xì)胞的抗原結(jié)構(gòu)（如血型抗原的分子機(jī)制）、犬免疫系統(tǒng)對(duì)紅細(xì)胞的識(shí)別與應(yīng)答規(guī)律。
- 用于建立犬紅細(xì)胞相關(guān)的免疫模型（如模擬輸血反應(yīng)的動(dòng)物模型），評(píng)估免疫抑制劑的療效。
生物實(shí)驗(yàn)與診斷試劑盒開發(fā)：
- 在犬血液學(xué)實(shí)驗(yàn)中，可通過 cRBC-McAb 特異性標(biāo)記犬紅細(xì)胞，用于流式細(xì)胞術(shù)分析紅細(xì)胞的數(shù)量、活性或形態(tài)變化。
- 作為核心試劑開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化診斷試劑盒（如犬血型檢測(cè)試劑盒、IMHA 診斷試劑盒），提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

四、優(yōu)勢(shì)與注意事項(xiàng)

核心優(yōu)勢(shì)：
- 特異性精準(zhǔn)：可針對(duì)單一血型抗原（如 DEA 1.1）或特定膜蛋白，避免與其他物種紅細(xì)胞（如人、貓紅細(xì)胞）的交叉反應(yīng)（需驗(yàn)證）。
- 標(biāo)準(zhǔn)化程度高：批次間差異小，適合臨床診斷的規(guī)范化應(yīng)用。
注意事項(xiàng)：
- 抗原表位的特異性：不同 cRBC-McAb 可能識(shí)別不同抗原（如 DEA 1.1 vs DEA 4），需根據(jù)應(yīng)用場(chǎng)景選擇匹配抗體（如血型鑒定需對(duì)應(yīng)目標(biāo)血型抗原）。
- 保存與活性維持：純化后的抗體需在 - 20℃凍存，避免反復(fù)凍融；使用前需驗(yàn)證活性（如通過凝集試驗(yàn)確認(rèn)）。

五、應(yīng)用前景

隨著犬作為伴侶動(dòng)物的地位提升，犬輸血安全和免疫性疾病的診斷需求日益增加。cRBC-McAb 的開發(fā)為解決犬血型鑒定難、IMHA 診斷不精準(zhǔn)等問題提供了關(guān)鍵工具。未來研究可聚焦于：

針對(duì)新型犬血型抗原（如尚未完全明確的血型系統(tǒng)）的 McAb 篩選，完善犬血型檢測(cè)體系；
開發(fā)多功能抗體（如同時(shí)具備診斷和治療潛力的雙特異性抗體），為 IMHA 等疾病的靶向治療提供新思路。

總之，cRBC-McAb 在獸醫(yī)臨床和基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用，推動(dòng)了犬類血液學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域的精準(zhǔn)化發(fā)展，對(duì)保障犬健康具有重要意義。

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