PROTAC透膜CD36蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制助力藥物研究
近期，Zhengyu Wang 等人在 Cell 發(fā)表標(biāo)題為：CD36-mediated endocytosis of proteolysis-targeting chimeras 的研究。該團(tuán)隊(duì)揭示了 CD36 是介導(dǎo) PROTAC 及 bRO5 化合物透膜的關(guān)鍵蛋白，通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化增加PROTAC 分子與 CD36 的親和力，可以明顯提高 PROTAC 透膜性，顯著增強(qiáng) PROTAC 的抗腫瘤功效。
Section.01
研究背景:
PROTACs 的潛力與困境
近年來，蛋白降解靶向嵌合體 (PROTACs, Proteolysis-Targeting Chimeras) 技術(shù)在靶向“不可成藥蛋白”領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力。這類分子通過同時(shí)結(jié)合靶蛋白和 E3 泛素連接酶，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病關(guān)鍵蛋白的精準(zhǔn)清除。然而，PROTACs 普遍結(jié)構(gòu)龐大、極性強(qiáng)，分子量通常超過 800 Da，遠(yuǎn)超“Lipinski 五原則”(即 Ro5) 對(duì)于藥物口服吸收的限制。
過去的研究多認(rèn)為這類分子“吸收差”、“難透膜”，其細(xì)胞攝取機(jī)制尚不明確。正因如此，開發(fā)高效、可吸收的 PROTAC 類藥物成為當(dāng)前藥物化學(xué)研究的重大挑戰(zhàn)。
Section.02
重磅發(fā)現(xiàn):
CD36 是介導(dǎo)大分子藥物透膜
的關(guān)鍵蛋白
由美國(guó)德克薩斯大學(xué)健康科學(xué)中心、杜克大學(xué)、阿肯色大學(xué)等機(jī)構(gòu)合作完成的一項(xiàng)研究表明，CD36 (cluster of differentiation 36) 是細(xì)胞攝取 PROTACs 和其他 Ro5 規(guī)則外屬性 (eRo5/bRo5) 分子的關(guān)鍵膜受體。研究團(tuán)隊(duì)利用生物素探針法、基因敲除/敲入技術(shù)、UPLC-MS 代謝組學(xué)及分子模擬等手段，發(fā)現(xiàn)：
- CD36 能結(jié)合多種 PROTAC 分子 (如 SIM1-Me、MZ1、ARV-110) 和大分子 (如雷帕霉素、navitoclax、birinapant、tubacin 和阿霉素) 的攝取，并促進(jìn)其療效。
- CD36 缺失會(huì)大幅降低這些藥物的細(xì)胞攝取效率及靶蛋白降解能力；CD36 表達(dá)恢復(fù)可顯著提升 PROTAC 的療效。
- CD36 介導(dǎo)的攝取依賴于經(jīng)典的內(nèi)吞通路 (Rab5/EEA1 早期內(nèi)體途徑) 。
- 通過結(jié)構(gòu)修飾提高 PROTAC 分子與 CD36 的結(jié)合活性，可以明顯提高 PROTAC 活性。
圖 1. CD36 介導(dǎo) PROTAC 及優(yōu)化后 PROTAC 透膜原理 [1]。
Section.03
研究亮點(diǎn):
從機(jī)制到應(yīng)用的系統(tǒng)性突破
發(fā)現(xiàn) CD36 可識(shí)別并內(nèi)吞多種"大分子藥物"
通過生物素標(biāo)記的 PROTAC 探針，結(jié)合細(xì)胞膜蛋白質(zhì)組篩選，研究者發(fā)現(xiàn) CD36 是多個(gè) PROTAC (如 CRBN-based PROTAC, VHL-based PROTAC) 和其他非傳統(tǒng)小分子藥物 (如 rapamycin、doxorubicin 等) 的結(jié)合對(duì)象。表明 CD36 不僅限于脂肪酸運(yùn)輸，其廣譜的配體識(shí)別能力使其成為“藥物轉(zhuǎn)運(yùn)”的潛在靶點(diǎn)。
圖 2. PROTAC 分子與 CD36 結(jié)合[1]。
(A) 三價(jià)生物素探針 BRD-VHL-biotin 的結(jié)構(gòu)；(B) BRD-VHL-biotin 與膜蛋白結(jié)合檢測(cè)流程：(C) PROTACs SIM1 與 SIM1-Me 結(jié)構(gòu)；(D) 密度分析 (左) 和代表性免疫印跡分析 (右) 顯示 CD36 在 LNCaP 細(xì)胞的膜和細(xì)胞質(zhì)組分中的相對(duì)表達(dá)；(E) 生物素 Pull-down 實(shí)驗(yàn)顯示 SIM1-Me 與 BRD-VHL-biotin 在指定條件下與 LNCaP 細(xì)胞膜組分中的 CD36 結(jié)合具有競(jìng)爭(zhēng)性；(F) 表面等離子共振分析 SIM1-Me 與 CD36 結(jié)合情況。
CD36 敲除顯著減少 PROTAC 及其他 bRO5 分子的攝入量
通過 shRNAs 降低 LNCaP PCa 細(xì)胞中 CD36 表達(dá)，構(gòu)建 shCD36-LNCaP 細(xì)胞系，用 10 nM SIM1-Me 或 50 nM ARV-110 對(duì) shCD36-LNCaP 細(xì)胞系進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，SIM1-Me 和 ARV-110 細(xì)胞攝入量分別下降了 5.6 倍和 19.6 倍。靶蛋白降解效率也大幅度降低。對(duì) shCD36-LNCaP 細(xì)胞毒性也分別下降了 15.8 倍和 423.3 倍。當(dāng) CD36 表達(dá)恢復(fù)后，細(xì)胞毒性也隨之恢復(fù)。并且，EEA1 的缺失有效地降低了 SIM1-Me 或 ARV-110 的細(xì)胞毒性。
這些結(jié)果證明：CD36 賴于經(jīng)典的內(nèi)吞通路 (Rab5/EEA1 內(nèi)吞途徑) 實(shí)現(xiàn)對(duì)大分子藥物攝取。
圖 3. PROTACs 依賴于 cd36 介導(dǎo)的內(nèi)吞作用來獲得細(xì)胞攝取、活性和生物學(xué)特性[1]。
(A-B) 免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，在指定條件下，shCD36 分別逆轉(zhuǎn)了 SIM1-Me (A) 和 ARV-110 (B) 對(duì) LNCaP 細(xì)胞中 BRD4 和 AR 的降解。(C-D) 免疫印跡分析顯示，在 shCD36-LNCaP 細(xì)胞中，帶有 HA 標(biāo)簽的 CD36 蛋白表達(dá)量增加，分別恢復(fù)了 LNCaP 細(xì)胞在指定條件下經(jīng) SIM1-Me (C) 和 ARV-110 (D) 處理時(shí) BRD4 和 AR 的降解。(E-H) 通過 MTT 測(cè)定法對(duì)不同濃度的 SIM1-Me (E)、ARV-110 (F)、MZ1 (G) 或紫杉醇 (H) 處理后，shEEA1+Vec-、shLuc+Vec-、shCD36+Vec-、shCD36+CD36-LNCaP 細(xì)胞的存活能力進(jìn)行了評(píng)估。
此外，shCD36 顯著降低 bRO5 分子的攝入和毒性，如下圖所示：
圖 4. ShCD36 逆轉(zhuǎn)表性 bRo5 藥物在 HCC1806 TNBC 細(xì)胞和 22Rv1 PCa 細(xì)胞中的細(xì)胞毒性 [1]。
增加 PROTAC 或 bRO5 分子對(duì) CD36 的親和力，顯著提高藥效
為提高 PROTAC 藥物對(duì) CD36 的親和力，研究者通過可裂解 linker 在 MZ1 PROTAC 結(jié)構(gòu)上引入可水解的極性基團(tuán) (通過添加帶負(fù)電荷的羧酸 (-COO⁻) 的鈉鹽形式、帶正電荷的伯胺 (-NH₃⁺) 的三氟乙酸鹽形式以及疏水性的中性 (叔丁氧羰基) 氨基 (-N-Boc) 部分)，開發(fā)出一系列“前藥型”PROTAC。這些優(yōu)化后的 PROTAC 分子增強(qiáng)了與 CD36 的親和力，其中優(yōu)化后分子 MZ1-C14-Na 與 MZ1-C12-NB 相比 MZ1 的細(xì)胞內(nèi)積累量分別提高 22.3 倍和 7.7 倍。相比 MZ1 分子，表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗腫瘤活性。在 HCC1806 和 22Rv1 細(xì)胞中，超過 60% 的 MZ1-C14-Na 與 MZ1-C12-NB 在 1 小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)化為 MZ1。
這表明，通過優(yōu)化 PROTAC 或大分子結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)對(duì) CD36 的親和力，可以提高藥物透膜性。
圖 5. 通過可切割鍵對(duì) CD36 進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，可以提高 PROTAC 的滲透性和活性[1]。
(A) 基于 vhl 的 BRD4 PROTAC MZ1 及其優(yōu)化 MZ1 類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和 CD36 結(jié)合親和力；(B-D) 免疫印記顯示經(jīng)空白、(+)-JQ1、 PROTAC MZ1 , 優(yōu)化后的 MZ1 類似物 MZ1-Cs-Na , MZ1-Cs-NH, 或 MZ1-Cs-NB 處理后，BRD4 在 HCC1806 或 22Rv1 中的表達(dá)量；(E) MZ1 及 MZ1-C14-Na 處理小鼠后，腫瘤體積變化；(F) MZ1 及麻醉-C12-NB 處理小鼠后，腫瘤體積變化。
Section.04
研究意義
1. 藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用
研究發(fā)現(xiàn) CD36 是促進(jìn) PROTACs、二價(jià)抑制劑及分子量較大藥物攝取的主要受體，范圍從 543 到 2145 Da。因此，在藥物發(fā)現(xiàn)中，通過相應(yīng)受體 (如 CD36) 的細(xì)胞攝取應(yīng)包括在化學(xué)內(nèi)吞劑的檢測(cè)流程中。
2. 藥物開發(fā)中的應(yīng)用
本研究發(fā)現(xiàn) CD36 是 PROTAC 及其他大分子進(jìn)入細(xì)胞的通用“載體”，這意味著可以借助結(jié)構(gòu)優(yōu)化提高 PROTAC 或其他大分子對(duì) CD36 的親和力，進(jìn)而提高此類化合物的細(xì)胞利用度。不過該理論還需進(jìn)一步研究。
3. 對(duì)精準(zhǔn)醫(yī)療和臨床實(shí)踐的應(yīng)用
CD36 蛋白的突變或缺失可能會(huì)影響 PROTAC 藥物活性或耐藥性，此外，一些臨床階段的 PROTACs 或可以通過提高介導(dǎo)受體 (如 CD36) 的親和力，提升其療效。
Section.05
小結(jié)
這項(xiàng)發(fā)表在 Cell 的突破性研究，首次將 CD36 定位為 bRo5 類藥物的關(guān)鍵內(nèi)吞受體，并提出了可推廣的“CD36 介導(dǎo)的化學(xué)內(nèi)吞”策略，極大拓展了大分子藥物研發(fā)的理論基礎(chǔ)與實(shí)踐路徑。隨著越來越多結(jié)構(gòu)復(fù)雜的新藥涌現(xiàn)，這項(xiàng)研究提供了一把打開“細(xì)胞門”的鑰匙，也為精準(zhǔn)醫(yī)療、抗癌藥物和 PROTAC 藥物開發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
但本研究對(duì) CD36 介導(dǎo)的藥物內(nèi)吞機(jī)制僅限于前列腺癌和乳腺癌細(xì)胞系，其他細(xì)胞類型的 PROTACs 細(xì)胞攝取是否普遍需要 CD36 需要進(jìn)一步研究。
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產(chǎn)品推薦 |
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MCE 可以提供850多種文獻(xiàn)報(bào)道的PROTAC 分子，靶向多種不同蛋白，可以用于機(jī)制研究或功能驗(yàn)證。 |
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MCE 可以提供350多種E3泛素酶配體，主要包括CRBN ，VHL ,MDM2 和IAP E3泛素鏈接酶配體�？梢杂糜赑ROTAC合成。 |
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目前MCE可以提供3000多種不同類型PROTAC linker, 涵蓋不同的結(jié)構(gòu)類型，包括PEG linker ，烷烴類linker ,點(diǎn)擊化學(xué)修飾linker等，可以用于PROTAC 合成。 |
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280+ Ligands for Target Protein for PROTAC MCE 收錄了280多種靶蛋白配體，涉及多種不同蛋白，可以用于PROTAC 設(shè)計(jì)合成。 |
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MCE 能夠提供 PROTAC 相關(guān)產(chǎn)品的設(shè)計(jì)、合成、分析、純化、優(yōu)化、檢測(cè)和評(píng)估等一站式服務(wù)。 |
[1] Wang Z, D et al. CD36-mediated endocytosis of proteolysis-targeting chimeras. Cell. 2025 Jun 12;188(12):3219-3237.e18.
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