通用型植物線粒體DNA萃取試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
通用型植物線粒體DNA萃取試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）
主要用途
通用型植物線粒體DNA萃取試劑是一種旨在通過(guò)物理或化學(xué)破膜及離心處理方法，從植物細(xì)胞或組織中分離出完整而純化的線粒體細(xì)胞器，然后進(jìn)一步生物酶處理以獲得高質(zhì)量的線粒體DNA的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適合于各種新鮮植物組織，包括葉片（leaf）、谷粒（grain）、種子（seed）、以及培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體核酸成分的分離。用于后續(xù)的雜交、克隆、酶切、PCR分析等。產(chǎn)品即到即用，操作簡(jiǎn)易，性能穩(wěn)定，無(wú)核酶污染，萃取純度和產(chǎn)量皆高。
技術(shù)背景
線粒體細(xì)胞器的研究是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)的最重要的課題之一。線粒體成為生物衰老、古生物、細(xì)胞凋亡、能量代謝等研究的主要對(duì)象。線粒體DNA的分離和定量以及突變分析是研究中必不可少的。
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 200毫升
裂解液（Reagent B） 80毫升
凈化液（Reagent C） 20毫升
強(qiáng)化液（Reagent D） 10毫升
保存液（Reagent E） 100毫升
破膜液（Reagent F） 6毫升
去干擾液（Reagent G） 600微升
酶解液（Reagent H） 600微升
萃取液（Reagent I） 6毫升
濃縮液（Reagent J） 2毫升
助沉液（Reagent K） 20微升
沉淀液（Reagent L） 20毫升
純化液（Reagent M） 20毫升
緩沖液（Reagent N） 1毫升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1份
保存方式
保存凈化液（Reagent C）、去干擾液（Reagent G）、酶解液（Reagent H）、萃取液（Reagent I）和助沉液（Reagent K）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月
用戶(hù)自備
15毫升錐形離心管：用于線粒體初步制備物的存放
50毫升錐形離心管：用于細(xì)胞或組織收集后離心或清洗
1.5毫升離心管：用于保存線粒體
4℃臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞
4℃超速離心機(jī)：用于分離細(xì)胞器成分
微型臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀核酸
尼龍絲或60微米尼龍網(wǎng)：用于去除植物裂解殘?jiān)?/P>
小型漏斗：用于過(guò)濾的裝置
DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞
58℃恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)物
渦旋震蕩儀：用于混勻
實(shí)驗(yàn)步驟
- 植物組織線粒體DNA分離（物理法）
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。
- 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量
- （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
- （選擇步驟）加入5毫升清理液（Reagent A）清洗1次
- 即刻用刀片切碎組織
- 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
- 加入預(yù)冷的5毫升裂解工作液
- 渦旋震蕩5秒，充分混勻
- 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)7）
- （選擇步驟）準(zhǔn)備1個(gè)小型漏斗，內(nèi)襯尼龍絲或60微米尼龍網(wǎng)，置于50毫升錐形離心管上
- （選擇步驟）將所有組織勻漿液移入到小型漏斗里過(guò)濾（注意：可以使用4層紗布替代）
- 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管，放入4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
- 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管（如果上清液含有肉眼可見(jiàn)的殘?jiān)貜?fù)離心5分鐘一次，速度為3000g）——此步驟去除細(xì)胞壁、淀粉顆粒、細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞以及完整質(zhì)體等殘?jiān)?/EM>
- 放入4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
- 小心抽去上清液，保留沉淀顆�！�此步驟獲得線粒體沉淀物（注意：如果暫時(shí)停止操作，須暫時(shí)放進(jìn)－70℃冰箱里）
- 加入300微升破膜液（Reagent F）到線粒體顆粒樣品中
- 渦旋震蕩15秒，混勻顆粒群
- 轉(zhuǎn)入1.5毫升離心管
- 置入冰槽中孵育15分鐘
- 加入30微升去干擾液（Reagent G）
- 用200微升槍頭上下抽吸混勻
- 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育15分鐘
- 加入30微升酶解液（Reagent H）
- 渦旋震蕩15秒
- 放進(jìn)58℃恒溫水槽或干式培養(yǎng)儀孵育2小時(shí)
- 置于室溫下冷卻15分鐘，直至處于室溫狀態(tài)（或置于冰槽里15至30秒）
- 加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前搖勻）
- 渦旋震蕩5秒
- 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
- 加入100微升濃縮液（Reagent J）到新的離心管
- 加入1微升助沉液（Reagent K）
- 加入800微升沉淀液（Reagent L）
- 在渦旋震蕩儀上震蕩5秒，充分混勻
- 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標(biāo)記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
- 小心抽掉上清液
- 加入1毫升純化液（Reagent M）
- 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心抽掉上清液
- 空氣中晾干沉淀顆粒群
- 加入20微升緩沖液（Reagent N）
- 溶解后放進(jìn)－20℃冰箱長(zhǎng)期保存或移出2微升進(jìn)行PCR反應(yīng)
- 植物組織線粒體DNA分離（化學(xué)法）
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。
- 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量
- （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
- （選擇步驟）加入5毫升清理液（Reagent A）清洗1次
- 移入一個(gè)液氮凍存管
- 即刻放入液氮罐過(guò)夜
- 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
- 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
- 加入預(yù)冷的5毫升裂解工作液
- 渦旋震蕩5秒，充分混勻
- 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
- 加入預(yù)冷的500微升強(qiáng)化液（Reagent D）
- 渦旋震蕩5秒，充分混勻
- 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)8）
- 加入預(yù)冷的5毫升保存液（Reagent E），輕輕搖動(dòng)試管混勻
- （選擇步驟）準(zhǔn)備1個(gè)小型漏斗，內(nèi)襯尼龍絲或60微米尼龍網(wǎng)，置于50毫升錐形離心管上
- （選擇步驟）將所有組織勻漿液移入到小型漏斗里過(guò)濾（注意：可以使用4層紗布替代）
- 放入4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
- 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管（如果上清液含有肉眼可見(jiàn)的殘?jiān)貜?fù)離心5分鐘一次，速度為3000g）——此步驟去除細(xì)胞壁、淀粉顆粒、細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞以及完整質(zhì)體等殘?jiān)?/EM>
- 放入4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
- 小心抽去上清液，保留沉淀顆�！�此步驟獲得線粒體沉淀物（注意：如果暫時(shí)停止操作，須暫時(shí)放進(jìn)－70℃冰箱里）
- 加入300微升破膜液（Reagent F）到線粒體顆粒樣品中
- 渦旋震蕩15秒，混勻顆粒群
- 轉(zhuǎn)入1.5毫升離心管
- 置入冰槽中孵育15分鐘
- 加入30微升去干擾液（Reagent G）
- 用200微升槍頭上下抽吸混勻
- 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育15分鐘
- 加入30微升酶解液（Reagent H）
- 渦旋震蕩15秒
- 放進(jìn)58℃恒溫水槽或干式培養(yǎng)儀孵育2小時(shí)
- 置于室溫下冷卻15分鐘，直至處于室溫狀態(tài)（或置于冰槽里15至30秒）
- 加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前搖勻）
- 渦旋震蕩5秒
- 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
- 加入100微升濃縮液（Reagent J）到新的離心管
- 加入1微升助沉液（Reagent K）
- 加入800微升沉淀液（Reagent L）
- 在渦旋震蕩儀上震蕩5秒，充分混勻
- 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標(biāo)記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
- 小心抽掉上清液
- 加入1毫升純化液（Reagent M）
- 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心抽掉上清液
- 空氣中晾干沉淀顆粒群
- 加入20微升緩沖液（Reagent N）
- 溶解后放進(jìn)－20℃冰箱長(zhǎng)期保存或移出2微升進(jìn)行PCR反應(yīng)
- 植物細(xì)胞或原生質(zhì)體線粒體DNA分離（物理法）
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。
- 準(zhǔn)備5 X 107植物細(xì)胞或原生質(zhì)體
- 移入一個(gè)50毫升錐形離心管
- 放入臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g
- 小心抽去上清液
- 加入5毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
- 放入臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
- 小心抽去上清液
- 加入預(yù)冷的5毫升裂解工作液
- 渦旋震蕩5秒，充分混勻細(xì)胞顆粒群
- 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞（約80下）（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)7）
- 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管，放入4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
- 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管（如果上清液含有肉眼可見(jiàn)的殘?jiān)貜?fù)離心5分鐘一次，速度為3000g）——此步驟去除細(xì)胞壁、淀粉顆粒、細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞以及完整質(zhì)體等殘?jiān)?/EM>
- 放入4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
- 小心抽去上清液，保留沉淀顆�！�此步驟獲得線粒體沉淀物（注意：如果暫時(shí)停止操作，須暫時(shí)放進(jìn)－70℃冰箱里）
- 加入300微升破膜液（Reagent F）到線粒體顆粒樣品中
- 渦旋震蕩15秒，混勻顆粒群
- 轉(zhuǎn)入1.5毫升離心管
- 置入冰槽中孵育15分鐘
- 加入30微升去干擾液（Reagent G）
- 用200微升槍頭上下抽吸混勻
- 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育15分鐘
- 加入30微升酶解液（Reagent H）
- 渦旋震蕩15秒
- 放進(jìn)58℃恒溫水槽或干式培養(yǎng)儀孵育2小時(shí)
- 置于室溫下冷卻15分鐘，直至處于室溫狀態(tài)（或置于冰槽里15至30秒）
- 加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前搖勻）
- 渦旋震蕩5秒
- 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
- 加入100微升濃縮液（Reagent J）到新的離心管
- 加入1微升助沉液（Reagent K）
- 加入800微升沉淀液（Reagent L）
- 在渦旋震蕩儀上震蕩5秒，充分混勻
- 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標(biāo)記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
- 小心抽掉上清液
- 加入1毫升純化液（Reagent M）
- 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心抽掉上清液
- 空氣中晾干沉淀顆粒群
- 加入20微升緩沖液（Reagent N）
- 溶解后放進(jìn)－20℃冰箱長(zhǎng)期保存或移出2微升進(jìn)行PCR反應(yīng)
- 植物細(xì)胞或原生質(zhì)體線粒體DNA分離（化學(xué)法）
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。
- 準(zhǔn)備5 X 107植物細(xì)胞或原生質(zhì)體
- 移入一個(gè)50毫升錐形離心管
- 放入臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g
- 小心抽去上清液
- 加入5毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
- 放入臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
- 小心抽去上清液
- 加入預(yù)冷的5毫升裂解工作液
- 渦旋震蕩5秒，充分混勻
- （選擇步驟）超聲波處理1分鐘
- 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
- 加入預(yù)冷的500微升強(qiáng)化液（Reagent D）
- 渦旋震蕩5秒，充分混勻
- 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)8）
- 加入預(yù)冷的5毫升保存液（Reagent E），輕輕搖動(dòng)試管混勻
- 放入4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
- 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管（如果上清液含有肉眼可見(jiàn)的殘?jiān)�，重�?fù)離心5分鐘一次，速度為3000g）——此步驟去除細(xì)胞壁、淀粉顆粒、細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞以及完整質(zhì)體等殘?jiān)?/EM>
- 放入4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
- 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物（注意：如果暫時(shí)停止操作，須暫時(shí)放進(jìn)－70℃冰箱里）
- 加入300微升破膜液（Reagent F）到線粒體顆粒樣品中
- 渦旋震蕩15秒，混勻顆粒群
- 轉(zhuǎn)入1.5毫升離心管
- 置入冰槽中孵育15分鐘
- 加入30微升去干擾液（Reagent G）
- 用200微升槍頭上下抽吸混勻
- 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育15分鐘
- 加入30微升酶解液（Reagent H）
- 渦旋震蕩15秒
- 放進(jìn)58℃恒溫水槽或干式培養(yǎng)儀孵育2小時(shí)
- 置于室溫下冷卻15分鐘，直至處于室溫狀態(tài)（或置于冰槽里15至30秒）
- 加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前搖勻）
- 渦旋震蕩5秒
- 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
- 加入100微升濃縮液（Reagent J）到新的離心管
- 加入1微升助沉液（Reagent K）
- 加入800微升沉淀液（Reagent L）
- 在渦旋震蕩儀上震蕩5秒，充分混勻
- 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標(biāo)記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
- 小心抽掉上清液
- 加入1毫升純化液（Reagent M）
- 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心抽掉上清液
- 空氣中晾干沉淀顆粒群
- 加入20微升緩沖液（Reagent N）
- 溶解后放進(jìn)－20℃冰箱長(zhǎng)期保存或移出2微升進(jìn)行PCR反應(yīng)
注意事項(xiàng)
- 本產(chǎn)品為20次操作（1克植物組織或5 X 107細(xì)胞）
- 線粒體操作均須在4℃或以下?tīng)顟B(tài)下進(jìn)行
- 操作時(shí)，須無(wú)菌操作，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）
- 建議使用足夠的組織或細(xì)胞量
- 建議植物組織使用組織勻漿器操作；德國(guó)的BRAUN細(xì)胞勻漿器最為理想
- 建議嚴(yán)格控制操作時(shí)間
- 通常勻化次數(shù)為80下（或細(xì)胞顆粒群/組織塊狀消失為止）達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細(xì)胞類(lèi)型會(huì)存在差異。用戶(hù)可以通過(guò)顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)。
- 通常孵育5分鐘達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細(xì)胞類(lèi)型會(huì)存在差異。用戶(hù)可以通過(guò)顯微鏡觀察3微升裂解物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時(shí)間和渦旋震蕩次數(shù)
- 裂解液（Reagent B）具有吸附去除酚類(lèi)物質(zhì)的作用
- 不同組織，其線粒體含量不同；通常1克植物組織的線粒體含量為10至50微克線粒體蛋白
- 試劑中的溶液使用前搖勻；酶解液（Reagent H）需放進(jìn)37℃凍溫育許；為避免反復(fù)凍融，建議適量分裝
- 通常1克植物組織或5 X 107細(xì)胞中提取的線粒體DNA達(dá)1至10微克
13． 本產(chǎn)品所獲得的線粒體DNA純度和產(chǎn)量最為理想，確保無(wú)核DNA和外源性DNA污染
- 本公司提供系列植物線粒體分析技術(shù)產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無(wú)核酶污染
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定萃取產(chǎn)量和純化程度高
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無(wú)基因組DNA污染
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