TEMPEST® 納升級分液器助力單細胞接種實驗自動化

介紹
細胞系的構(gòu)建是一個漫長而乏味的過程，需要投入大量的勞動力和材料。一旦開發(fā)出細胞系，下游實驗就需要標準化的細胞接種和均勻的細胞密度以獲得可量化的結(jié)果。細胞系開發(fā)的主要挑戰(zhàn)有單克隆性和穩(wěn)健克隆生長的實現(xiàn)以及過程中細胞的高活性和無菌性。細胞系開發(fā)中的這些挑戰(zhàn)可以通過使用自動細胞分配來解決，從而在不影響細胞活性的情況下實現(xiàn)高通量均勻分配。本研究將使用 FORMULATRIX® 公司的 TEMPEST® 納升級自動分液器將 CHO-K1 細胞分配至 384 孔板與使用手持電動移液器進行同樣操作進行了比較。
FORMULATRIX 公司的TEMPEST 系統(tǒng)是一款非接觸式高通量試劑分配器，進行配置后，能夠通過 96 個獨立控制的噴嘴同時分配任意體積的多達 12 種不同的試劑。 TEMPEST 的再循環(huán)功能通過保持懸浮液的均勻性來確保細胞的均勻分配。再循環(huán)功能通過抑制細胞沉積來避免芯片堵塞； 這樣，可以保證最大的細胞活性。 TEMPEST 基于微隔膜的技術(shù)可以精確分配低至 200 nL 的體積，每個芯片的死體積為 48 μL，使其有可能適用于在多孔板中接種細胞。  
材料和方法
細胞培養(yǎng)和細胞接種
CHO-K1 細胞在 F-12K 培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)。用胰蛋白酶-EDTA 收集細胞并重懸于培養(yǎng)基中。細胞兩次通過 40 μm 細胞濾網(wǎng)，得到細胞懸浮液并將其稀釋至 200 個細胞/mL。為了每孔接種一個細胞，使用 TEMPEST 或手持電動多通道移液器將 5 μL 細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到 384 孔板的每個孔中。
 
活性和接種效率
 為了確定CHO-K1 細胞過夜恢復(fù)后的細胞活性，我們將其制備成細胞懸浮液（5000 個細胞/ml），并使用 TEMPEST 或電動移液器以 100μl/孔移液到 384 孔板中，最終實現(xiàn) 500 個細胞/孔的濃度。
 
微孔板成像
 所有實驗的微孔板均使用 Celígo 成像細胞儀進行成像，以獲得細胞計數(shù)、實現(xiàn)單細胞接種和隨后的克隆生長的可視化。我們使用熒光顯微鏡對細胞進行檢測，而明場顯微鏡則被用于驗證單細胞的存在和克隆生長。 圖片拍攝于第 0 天和第 4 天。
 
結(jié)果和討論
單細胞接種和細胞克隆生長
 數(shù)據(jù)顯示，在第 0 天，手動接種后 36% (3% CV) 的孔存有單細胞，而使用TEMPEST得到 32% (2% CV)的孔存有單細胞，過程中無統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01，n=3）（圖 1A） )。 監(jiān)測細胞培養(yǎng)進一步表明，在第 4 天，手動分配時克隆生長數(shù)據(jù)為 91%（6% CV），通過 TEMPEST 分配的數(shù)據(jù)為 91%（4% CV），過程中無統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01，n=3）（圖 1B） 。在第 0 天和第 4 天，通過視覺跟蹤監(jiān)測克隆生長的比較，可以看到單細胞生長成菌落的板孔的掃描圖（圖 2）。 這表明 TEMPEST 在接種單細胞時與手動使用電動移液器的實驗效果一樣好。盡管這兩者的分配機制非常不同，但 TEMPEST 不會影響長期細胞活性。  
   
活性和接種效率
 使用 TEMPEST 和電動移液器進行細胞接種時，細胞活性測量值分別為 97.4%（1.1% CV）和 98.98%（0.7% CV）。 兩個實驗中的細胞在接種后恢復(fù)程度相當。對整個微孔板的細胞計數(shù)進行比較表明，TEMPEST 具有更好的重現(xiàn)性，CV 為 10%，而電動移液器的 CV 為 17%（圖 3）。 TEMPEST 細胞接種的較低方差體現(xiàn)在其分液體積精度和通過持續(xù)再循環(huán)維持均勻細胞懸浮液的能力。
 
手動與自動液體分配和板孔分析的對比
 使用 TEMPEST 進行分配可將通量提高 25 倍，以此分配細胞并分析孔中是否存在單個細胞。數(shù)據(jù)顯示使用 TEMPEST 系統(tǒng)從手動分配的 118 個樣本/小時顯著提高為 3008 個樣本/小時（圖 4）。 這一結(jié)果不足為奇，因為 TEMPEST 僅使用一個芯片便可在大約八分鐘內(nèi)以每孔 100 ul 的速度填充 384 孔板。 如果 TEMPEST 使用所有 12 個芯片進行相同的分配，則此分配時間會減少至大約一分鐘。
   
   
總結(jié)
 根據(jù)以上數(shù)據(jù)，我們可以得出結(jié)論，TEMPEST芯片中所使用的微型隔膜泵技術(shù)對于處理CHO K1細胞的稀懸液和濃懸液都足夠溫和，與傳統(tǒng)的排氣式移液器沒有顯著差異。TEMPEST 再循環(huán)功能使懸浮液保持均勻，加上儀器的高分液體積精度，與相同的移液器相比，可降低細胞接種差異。 TEMPEST 大大縮短了接種時間，將通量提高了 25 倍。 雖然這項工作是使用 CHO 細胞和 TEMPEST 進行的，但使用有著相同微隔膜技術(shù)的 MANTIS 儀器大概率可以通過其他細胞類型或以較低的通量實現(xiàn)類似的性能，因此這兩款儀器都非常適合基于細胞的工作流程。