使用非接觸分液系統(tǒng)進行高通量 Covid-19 RT-qPCR 測定

全球范圍的Covid-19傳染導致了對大規(guī)模診斷測試的急切需求變得前所未有。在為檢測和監(jiān)測SARS-CoV-2 冠狀病毒而開發(fā)的各種方法中，定量逆轉(zhuǎn)錄 PCR (RT-qPCR) 因其簡單、靈敏性和可靠性而成為目前的首選方法。RT-qPCR 的另一個優(yōu)勢是它非常適合大規(guī)模操作，能夠處理大量患者樣本，而在一工作流程中可以加入自動化液體處理器。然而，由于許多自動化液體處理器有著較大的死體積和一次性吸頭形式的高塑料制品要求，因此這樣的實驗進展可能會受到全球 RT-qPCR 試劑和自動化耗材供應(yīng)短缺的限制。

牛津大學 MRC Weatherall 分子醫(yī)學研究所 (WIMM) 的研究人員為了解決這個問題，最近將MANTIS® 液體處理器集成到現(xiàn)有的 Covid-19 RT-qPCR 工作流程中。非接觸式分液顯著減少了移液器吸頭的使用，并且高精度的小容量分液為測定小型化提供了充足的機會，MANTIS 液體處理器不僅增加了通量，而且還降低了成本。通過與約翰拉德克利夫醫(yī)院的合作證明了這種應(yīng)對流行病方法的價值，在此，已知的 Covid-19 陽性和陰性樣本在兩種情況下的一致性 > 95%。

圖 1. 典型的臨床測試工作流程

臨床工作流程需要擴大測試規(guī)模以應(yīng)對不斷增長的測試需求

先收集患者拭子，然后使用 RT-qPCR 檢測 RNA 病毒（圖 1）的典型臨床工作流程。然后將其帶到封閉等級為 3 級的無塵室，之后將樣品材料手動轉(zhuǎn)移到含有裂解緩沖液的管中并加熱以裂解細胞。接下來，在通過 RT-qPCR 擴增之前，通常使用基于移液器吸頭的液體處理儀器從樣品中提取 RNA。然后分析數(shù)據(jù)并將結(jié)果上傳到實驗室信息管理系統(tǒng) (LIMS)。

盡管這樣的工作流程非常有效，但應(yīng)對 Covid-19 需要大規(guī)模測試。這意味著我們需要將試管更換為 96 或 384 孔板，并使用大型自動化液體處理器來提高 RNA 提取和純化的通量。此外，我們還必須采取措施簡化 RNA 測序和后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

大型自動化液體處理器面臨諸多挑戰(zhàn)

使用大型自動化液體處理器來增加 Covid-19 RT-qPCR 工作流程的吞吐量會面臨的一個主要問題是不可避免地依賴制造商提供大量一次性塑料制品，尤其是專有吸頭。隨著全球需求飆升造成了供應(yīng)短缺，許多實驗室因此無法正常工作。此外，與使用吸頭相關(guān)的高死體積意味著所需試劑的獲取仍然是另一個關(guān)鍵限制因素。

由于許多大型自動化液體處理器無法在微孔板格式之間輕松切換（例如 96 孔板到 384 孔板），在必須手動更換移液頭時增加了工作流程的額外時間，因此會造成實驗挑戰(zhàn)。在涉及多種液體類別的情況下，缺乏可靠、一致的移液也會帶來問題，特別是粘性試劑特別難以處理，并且通常需要重復測試，造成延誤和成本增加。

非接觸式分液減少了塑料制品和試劑的使用

為了克服使用大型自動化液體處理器處理患者樣本帶來的相關(guān)挑戰(zhàn)，WIMM 的研究人員最近選擇將 MANTIS 液體處理器（圖 2）集成到現(xiàn)有的 Covid-19 RT-qPCR 工作流程中。他們選擇MANTIS 液體處理器的一個主要原因是該系統(tǒng)非接觸式分液的能力，即使用可重復使用的微流控芯片代替移液器吸頭，以準確分配液體，而且沒有交叉污染的風險。MANTIS 液體處理器的占地面積小，這使得它能放置在生物安全柜內(nèi)，從而確保研究人員在處理具有潛在傳染性的患者樣本材料時的安全。

圖 2. MANTIS® 液體處理器

MANTIS 液體處理器的其他重要特性使其特別適合 WIMM Covid-19 RT-qPCR 工作流程，包括它能夠準確分配各種體積 - 從低至 100 nL 到毫升量，具有極 低死體積 ，并且可以輕松地在不同的孔板格式之間切換。結(jié)合MANTIS 液體處理器能夠處理許多不同類型的液體，它的這些功能為分析小型化提供了充足的可能性，而這是在使用昂貴的試劑（例如目前PCR 緩沖液供應(yīng)有限 ）時的關(guān)鍵考慮因素。

使用 MANTIS® 液體處理器提高 Covid-19 RT-qPCR 通量

如果要了解研究人員如何使用 MANTIS 液體處理器來提高工作流程效率，那么了解 WIMM Covid-19 RT-qPCR 測定的執(zhí)行方式就顯得非常重要。簡而言之，qPCR 探針（來自寡核苷酸供應(yīng)商的 N1 和 N2 FAM 探針，或?qū)φ仗结槪┰?nbsp;TE 緩沖液中預(yù)混合，并使用 MANTIS 分配到384 孔板中。接下來，使用 384 通道移液器將樣品 RNA 添加到探針中，進行微孔板板間的直接轉(zhuǎn)移。之后使用市售的 RT 酶混合物進行逆轉(zhuǎn)錄，接著使用合適的實時熱循環(huán)儀執(zhí)行qPCR（圖 3）。

圖 3. WIMM 高通量 COVID-19 RT-qPCR 工作流程

與手動處理相比，通過將 MANTIS 液體處理器與 384 通道移液器相結(jié)合，可以在更短的時間內(nèi)設(shè)置更多數(shù)量的微孔板；實驗人員使用MANTIS，可以將 qPCR 探針在 4 分鐘內(nèi)添加到整個 384 孔板中。通過使用更大的試劑容器（例如 50 mL 離心管）可以進一步提高通量，并且在必要時，可以通過將反應(yīng)板放置在位于儀器平臺上的冷卻 SBS 尺寸冷卻模塊上來保持反應(yīng)低溫。

試劑分配的靈活性使測定小型化

我們與 John Radcliffe 醫(yī)院合作對 WIMM Covid-19 RT-qPCR 工作流程進行了改進。此次合作的總體目標是在不影響檢測靈敏度的情況下減少試劑的使用，并要求在對 John Radcliffe 臨床醫(yī)生所提供的已知陽性和陰性 Covid-19 患者樣本材料進行驗證之前先完善 RT-qPCR 工作流程。

最初，WIMM 研究人員評估了檢測量減少所造成的影響。在早期測試數(shù)據(jù)（圖 4）中可以看出，在單重測定格式中將 N1 和 N2 預(yù)混液的體積從 15 µL 減半至 7.5 µL 對靈敏度沒有產(chǎn)生不利影響；在這兩種情況下，該檢測方法幾乎都能檢測到一個 Covid-19 RNA 拷貝。

接下來，通過將 N2 探針與 Cy5 標記的對照探針（圖 4）組合來評估 RT-qPCR 測定對多重測定的適用性，其中單獨使用 N2 探針或與 Cy5 標記的對照探針組合生成標準曲線再次證明測定靈敏度沒有明顯變化。

在這些實驗成功之后，WIMM 研究人員使用修訂后的實驗方案對來自 96 個已知 Covid-19 狀態(tài)的鼻咽拭子樣本中的純化 RNA 進行盲測。所有測試水平的結(jié)果都表明兩個情況之間的一致性 > 95%，并且所有陰性樣本都是非反應(yīng)性的。

圖 4. 在全體積和半體積下進行的 N1 和 N2 單重測定顯示出相似的靈敏度

使用MANTIS® 液體處理器完善了工作流程，這已得到驗證
通過將 MANTIS 液體處理器集成到 Covid-19 RT-qPCR 的現(xiàn)有工作流程中，一致且可靠的非接觸式分液提高了通量并消除了對制造商專有吸頭的依賴——這意味著全球供應(yīng)短缺不再是阻止 RT-qPCR 測定以所需容量運行的障礙。MANTIS液體處理器在減少檢測量、顯著節(jié)省成本以及在試劑短缺時避免延誤等方面也發(fā)揮了關(guān)鍵作用。最后，MANTIS 液體處理器通過處理多重測定所需的復雜移液操作，確保即使是那些沒有使用自動化液體處理器經(jīng)驗的人也可以輕松地進行多因子 RT-qPCR 實驗。