II. 概論
使用SSsc試劑盒進(jìn)行384次反應(yīng),精確計(jì)算如下試劑體積,為了確保有足夠的試劑進(jìn)行384次四分之一 體積的反應(yīng),請(qǐng)務(wù)必遵守LV、HV芯片的灌注和預(yù)分配體積。
每一個(gè)新的添加物使用一個(gè)新的芯片。在一天運(yùn)行結(jié)束后,按照相應(yīng)的洗滌步驟清洗所有LV和HV芯 片。
注意避免在整個(gè)過程中出現(xiàn)氣泡。
有關(guān)SMART-Seq單細(xì)胞套件的更多信息,請(qǐng)參閱SMART-Seq單細(xì)胞套件用戶手冊(cè)。
III. 實(shí)驗(yàn)步驟
A. 用于細(xì)胞分選的384孔板的制備
1. 為了制作CDS分選溶液(CSS),首先手動(dòng)注入114μl 10X裂解緩沖液到1.5 ml無核酸酶管中。
2. 添加6μl核糖核酸酶抑制劑(40 U /μl),通過緩慢混合后快速旋轉(zhuǎn)試劑。
3. 將120μl的3’SMART-Seq CDS Primer II A加入到10X反應(yīng)緩沖液中(總體積為60μl)。
4. 加1,260μl無核酸酶水(總體積1,500μl)。
5. 緩慢旋轉(zhuǎn)混合物。
6. 將750μl的CSS注入兩個(gè)1000μl的吸管剪短,并將尖端裝入LVMANTIS芯片(位置1和2)。通過對(duì) MANTIS液體處理器編寫程序,從選擇的位置添加3.2μl CSS到每個(gè)孔中。
注:在本實(shí)驗(yàn)方案中,我們假設(shè)FACS對(duì)細(xì)胞的分選不會(huì)改變板孔中液體的體積。如果分選機(jī)分配了不可忽略體積的鞘液 量,可通過減少無核酸酶水的量來調(diào)整CSS混合物的體積,使其總體積保持在3.2μl /孔。
安全停止點(diǎn):孔板可在-20°C保存過夜。
B. 細(xì)胞分類
1. 將細(xì)胞直接注入含有CSS的板孔中。
2. 分類完成后,將孔板密封,并將其快速旋轉(zhuǎn),使細(xì)胞到達(dá)孔的底部。
3. 立即將孔板放置于干冰上約5分鐘,然后轉(zhuǎn)移到-80°C的冰箱。
安全停止點(diǎn):孔板可在-80°C保存過夜。
C. 低聚糖退火
1. 從-80°C的冰箱中取出孔板,讓它解凍約1分鐘,并輕微旋轉(zhuǎn)。然后,向下旋轉(zhuǎn)孔板,收集孔底的 內(nèi)容物。
2. 將孔板轉(zhuǎn)移到預(yù)熱過的熱循環(huán)器中,在72°C孵化3分鐘。
3. 孵化3分鐘后,放置到冰塊上2分鐘。
4. 當(dāng)孔板放在冰上時(shí),準(zhǔn)備RT反應(yīng)混合液(D部分)。
D. RT反應(yīng)混合液的制備
1. 將下列試劑按如下順序室溫添加到1.5 ml無核酸酶管中,制備足夠的RT反應(yīng)混合物,進(jìn)行384次 反應(yīng)。務(wù)必在使用前最后添加SMARTScribe™II逆轉(zhuǎn)錄酶,上下輕輕混合。
*該圖表詳細(xì)說明了每種成分進(jìn)行384次反應(yīng)所需的量(相當(dāng)于一孔板的量),包括以計(jì)算移液誤差的補(bǔ)充體積。
2. 在1,000μl的移液管吸頭加入804μl的RT反應(yīng)混合也,裝入LV MANTIS MANTIS液處理器編程,將1.9μl的RT反應(yīng)混合液加入到選擇的孔中。
3. 用封口膠帶密封孔板,收集試劑,輕輕旋轉(zhuǎn)3-5次孔板。
4. 以每分鐘2000轉(zhuǎn)的速度旋轉(zhuǎn)孔板30-60秒。
E. 第一鏈的合成
1. 將孔板從D部分轉(zhuǎn)移到一個(gè)預(yù)熱的熱循環(huán)器中,并運(yùn)行以下程序
2. 程序完成后,以每分鐘2000轉(zhuǎn)的速度旋轉(zhuǎn)平板30-60秒。
安全停止點(diǎn):孔板可在4°C保存過夜。
F. PCR擴(kuò)增cDNA
1. 將以下試劑按照順序加入到2.0 ml冰管中,準(zhǔn)備足夠的384個(gè)反應(yīng)的PCR反應(yīng)混合液。請(qǐng)務(wù)必在 使用前最后添加SeqAmp™DNA聚合酶,上下輕輕混合。
*該圖表詳細(xì)說明了每種成分進(jìn)行384次反應(yīng)所需的量(相當(dāng)于一孔板的量),包括以計(jì)算移液誤差的補(bǔ)充體積。
2. 在6個(gè)1000μl的移液管吸頭加入1030μl PCR主混合液,將每個(gè)吸頭裝入HV MANTIS 芯片(位置 1-6)。每1000μl的移液器吸頭,使用MANTIS液體處理器編程,在E階段制備的孔板每孔中加入 15μl的PCR主混合液。
3. 用封口膠帶密封孔板,收集試劑,輕輕旋轉(zhuǎn)3-5次孔板。
4. 以每分鐘2000轉(zhuǎn)的速度旋轉(zhuǎn)孔板30-60秒。
5. 將孔板轉(zhuǎn)移到預(yù)熱過的熱循環(huán)器中,運(yùn)行以下程序:
*使用以下表格作為指導(dǎo),以幫助確定輸入的最佳PCR循環(huán)次數(shù):
安全停止點(diǎn):孔板可在4°C保存過夜。
G. 用NucleoMag NGS純化及片段選擇純化擴(kuò)增的cDNA
cDNA可以通過NucleoMag NGS的純化及片段選擇(Takara Bio, 744970.5, 744970.50,或 744970.500)純化。
注:NucleoMag NGS的純化及片段選擇磁珠懸浮可以用等量的agcourt AMPure XP磁珠代替。
1. 每次使用前,取適量置于室溫下至少30分鐘,攪拌均勻即可。
2. 每次實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備新鮮的80%乙醇。每個(gè)樣品需要100μl。
3. 需要一個(gè)能容納384孔板的磁力分離架。
4. 將NucleoMag NGS的純化及片段選擇磁珠混合均勻,然后在每個(gè)樣品中加16μl。
5. 通過輕輕旋轉(zhuǎn)或上下?lián)u晃移液至少10次,徹底混合。
6. 室溫孵化8分鐘,讓cDNA與磁珠結(jié)合。
7. 輕輕地旋轉(zhuǎn)樣品,從樣品孔的側(cè)面收集液體。將樣品放在磁力分離架上約5分鐘或更長時(shí)間,直 至液體完全清澈,上清液中無磁珠殘留。
8. 當(dāng)樣品放在磁力分離架上時(shí),用移液管移去上清液并丟棄。
9. 把樣品放在磁力分離架上。每個(gè)樣品添加50μl新鮮配制的80%乙醇,不干擾磁珠。等待30秒后, 小心移去含有污染物的上清液。在清洗過程中, cDNA將繼續(xù)結(jié)合在磁珠上。
10. 重復(fù)乙醇清洗(步驟9)一次。
11. 輕輕地旋轉(zhuǎn)樣品,從樣品孔的側(cè)面收集液體。將樣品放在磁力分離架上30秒,然后用吸管除去所 有剩余的乙醇。
12. 在室溫下放置樣品約2-2.5分鐘,直到顆粒不再有光澤,但在裂紋出現(xiàn)之前。
13. 待磁珠干燥后,加17μl的洗脫緩沖液蓋住磁珠。從磁力分離架中取出樣品,徹底混合,重新懸浮磁珠。
14. 室溫孵化2分鐘以補(bǔ)水。
15. 輕輕地旋轉(zhuǎn)樣品,從樣品孔的側(cè)面收集液體。將樣品放在磁力分離架上約1分鐘或更長時(shí)間,直 至液體完全清澈。
16. 將含有純化cDNA的上清液從每個(gè)孔轉(zhuǎn)移到無核酸酶,低粘附力的管中。在每個(gè)試管上貼上樣品 信息標(biāo)簽,并在-20°C保存,直到庫準(zhǔn)備好。
安全停止點(diǎn):孔板可在-20°C保存過夜。
17. 參考SMART-Seq Single Cell Kit用戶手冊(cè),了解量化和庫準(zhǔn)備選項(xiàng)。