生物制藥領(lǐng)域支原體檢測的主流方法

在生物制藥領(lǐng)域，支原體污染可能影響產(chǎn)品安全性和有效性，因此檢測方法需具備高靈敏度、特異性和可靠性。目前該領(lǐng)域支原體檢測的主流方法如下：
 
一、核酸擴增法（NAT-PCR ）
原理：通過設(shè)計針對支原體保守基因的特異性引物，利用 PCR 或?qū)崟r熒光定量 PCR（qPCR）技術(shù)擴增樣本中的支原體核酸，通過熒光信號或電泳結(jié)果判斷是否存在污染。
特點（qPCR法）：
靈敏度高：配合抽提方案，可檢測低至 10¹ CFU/mL 的支原體。
速度快：2-4 小時內(nèi)可出結(jié)果，優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)法。
特異性強：引物針對支原體特有序列，減少其他微生物干擾。
適用范圍廣：可檢測細胞培養(yǎng)上清、發(fā)酵液、純化產(chǎn)物等多種樣本類型。
應(yīng)用場景：生物制藥生產(chǎn)過程中的中間產(chǎn)物，以及細胞庫、培養(yǎng)基的常規(guī)監(jiān)控。
二、支原體培養(yǎng)法（經(jīng)典金標準）
原理：將樣本接種于含血清、酵母提取物等營養(yǎng)成分的特殊培養(yǎng)基（如 Hayflick 培養(yǎng)基、PPLO 培養(yǎng)基）中，在適宜溫度（35-37℃）和氣體環(huán)境下培養(yǎng)，觀察是否出現(xiàn)典型的 “油煎蛋” 狀菌落。
特點：
準確性高：可直接培養(yǎng)并鑒定活支原體，是藥典（如《中國藥典》3301 支原體檢查法）規(guī)定的參考方法。
可進行藥敏試驗：若培養(yǎng)陽性，可進一步測試抗生素敏感性，指導(dǎo)污染處理。
缺點：培養(yǎng)周期長（需 21 天以上），操作復(fù)雜，對實驗室環(huán)境和技術(shù)要求高。
應(yīng)用場景：用于法規(guī)要求的最終產(chǎn)品放行檢測。
三、指示細胞法
原理：是一種通過觀察特定細胞（指示細胞）在支原體污染后的形態(tài)或功能變化，來間接檢測支原體的方法。
特點：
直觀性：通過細胞形態(tài)或代謝變化直接反映支原體感染，無需復(fù)雜儀器，適合基層實驗室。
模擬生理環(huán)境：指示細胞與支原體的相互作用更接近實際感染場景，可檢測部分難以用核酸或培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)的苛養(yǎng)型支原體。
缺點：需較高濃度的支原體（10⁴-10⁵ CFU/mL）才能觀察到明顯變化，易漏檢早期或低水平污染；耗時較長，共培養(yǎng)需 3-7 天；特異性差，結(jié)果判斷易受人為因素影響。
應(yīng)用場景：初步篩查，在缺乏 PCR 設(shè)備的實驗室中，作為支原體污染的初篩手段，尤其是細胞培養(yǎng)過程中的日常監(jiān)控。
 
幾種方法的對比

檢測方法	靈敏度	檢測時間	特異性	操作復(fù)雜度	法規(guī)符合性
指示細胞法	低	3-7 天	低	低	非藥典主流方法
培養(yǎng)法	中	21 天以上	高	高	藥典金標準
核酸擴增法（qPCR 法）	高	2-4 小時	高	中	藥典可選：經(jīng)過驗證后，可以選用