活性氧(ROS)檢測探針H2DCFDA的作用機(jī)理及應(yīng)用案例

 

H2DCFDA（2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯，AbMole，M9096）是一種常用的活性氧（ROS）熒光探針，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域的研究。H2DCFDA是一種細(xì)胞滲透性指示劑，在細(xì)胞內(nèi)的酯酶作用下，其乙酸基團(tuán)被去除，產(chǎn)物為H2DCF。此時(shí)處于非熒光狀態(tài)，并且無法再通過細(xì)胞膜。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在氧化環(huán)境時(shí)，H2DCF會(huì)被氧化為發(fā)綠色熒光的2,7-二氯二氫熒光素（DCF，EX/EM = 488/525 nm），從而可用于檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。

圖 1. H2DCFDA檢測ROS的原理

 

H2DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）作為一種細(xì)胞滲透性探針，能夠有效檢測細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激和ROS水平。H₂DCFDA可以檢測過氧化氫（H₂O₂）、超氧陰離子（O2⁻）、羥基自由基（·OH）和過氧亞硝酸鹽（ONOO⁻）等ROS。一般可將細(xì)胞與H2DCFDA（多數(shù)情況下濃度為10 µM）孵育30分鐘，然后用流式細(xì)胞術(shù)或者熒光顯微鏡進(jìn)檢測。注意染色過程中要使用無血清的培養(yǎng)基，以免影響檢測結(jié)果。

 

近年來，鐵死亡（Ferroptosis）研究取得了顯著進(jìn)展，H₂DCFDA作為檢測工具在其中發(fā)揮了重要作用。通過檢測細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，并結(jié)合ABDP 581/591 C11（AbMoel，M29325）進(jìn)行脂質(zhì)過氧化檢測，以及CCK-8（AbMole，M4839）等進(jìn)行細(xì)胞活力分析，可以分析細(xì)胞死亡的主要原因和類型。2014年，AbMole的兩款抑制劑分別被西班牙國家心血管研究中心和美國哥倫比亞大學(xué)用于動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，相關(guān)科研成果發(fā)表于頂刊 Nature 和 Nature Medicine。

 

蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院的研究人員設(shè)計(jì)了一種水凝膠（FDA-TA），它可通過重塑鐵代謝來修復(fù)組織。FDA-TA可以吸附胞外的鐵離子，以調(diào)節(jié)鐵代謝并抑制鐵死亡，進(jìn)而促進(jìn)組織修復(fù)。研究者構(gòu)建了大鼠尾椎穿刺模型，來評(píng)估FDA-TA對(duì)椎間盤退行性病變（IVDD）的抑制效果。實(shí)驗(yàn)人員在探究鐵離子（Fe3+）能否引起細(xì)胞氧化應(yīng)激和鐵死亡的實(shí)驗(yàn)中，使用了AbMole的H2DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）和JC-1（AbMole，M9724），它們分別被用于檢測活性氧（ROS）的生成和線粒體膜電位的變化[1]。
 

圖 2. Fe3+可以誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激和線粒體膜電位異常[1]

 

蘭州大學(xué)、寧夏醫(yī)科大學(xué)的研究者們?cè)谏鲜稣撐闹醒芯苛薈2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子OSIC1在楊樹中對(duì)滲透脅迫下氣孔關(guān)閉的正向調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，OSIC1在鹽、干旱、聚乙二醇6000（PEG6000）和脫落酸（M7597，ABA）誘導(dǎo)下表達(dá)上調(diào)。過表達(dá)OSIC1的轉(zhuǎn)基因楊樹在上述處理?xiàng)l件下表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性，這主要是通過減少氣孔開度來實(shí)現(xiàn)的。而通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)產(chǎn)生的OSIC1突變體則表現(xiàn)出相反的表型。此外，OSIC1能夠直接上調(diào)PalCuAOζ的表達(dá)，該基因編碼一種含銅多胺氧化酶，可增強(qiáng)保衛(wèi)細(xì)胞（ guard cells，負(fù)責(zé)儲(chǔ)存淀粉調(diào)節(jié)滲透壓的細(xì)胞）的過氧化氫積累，從而在環(huán)境壓力發(fā)生時(shí)調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉。在這項(xiàng)研究中，AbMole的H2DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）被用來檢測楊樹保衛(wèi)細(xì)胞在不同處理?xiàng)l件下的H₂O₂積累情況[2]。
 

圖 3. Detection of H2O2 in guard cells under different treatments[2].

 

蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院的研究者們?cè)谏鲜鑫恼轮醒邪l(fā)了一種以黑色素為原型的微囊（BHB-PDA-MCs），用于肝纖維化（HF）的抑制。BHB-PDA-MCs的核心為水相，外殼由聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）和聚多巴胺納米顆粒（PDANPs）組成。PDANPs是天然黑色素的合成類似物，具有抗氧化特性。而微囊的核心用于封裝酮體β-羥基丁酸（BHB），這是一種已知的免疫代謝調(diào)節(jié)劑，能夠抑制NLRP3炎癥體的激活。在體外實(shí)驗(yàn)中，PDANPs能夠減輕H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞（LO2細(xì)胞）和肝星狀細(xì)胞（HSC-T6細(xì)胞）的氧化水平，而BHB能夠減少巨噬細(xì)胞（Raw264.7細(xì)胞）產(chǎn)生的促炎和促纖維化因子；在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中，研究者發(fā)現(xiàn)BHB-PDA-MCs能夠抑制HSCs的激活，減少ECM蛋白的沉積，減輕肝小葉的損傷，并保護(hù)肝功能。在這項(xiàng)研究中，AbMole的H2DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）被用來檢測LO2和HSC-T6細(xì)胞在H2O2刺激下的氧化水平和微囊系統(tǒng)的保護(hù)作用。
 

圖 4. Fluorescent images showing the ROS levels in LO2 or HSC-T6 cells after co-cultured with blank control, H2O2, or PDA-MCs[3]

 

AbMole是ChemBridge中國區(qū)官方指定合作伙伴。

 

 

[1] Y. Xu, F. Cai, Y. Zhou, et al., Magnetically attracting hydrogel reshapes iron metabolism for tissue repair, Science advances 10(33) (2024) eado7249.

[2] Q. Bai, Z. Niu, Q. Chen, et al., The C(2) H(2) -type zinc finger transcription factor OSIC1 positively regulates stomatal closure under osmotic stress in poplar, Plant biotechnology journal 21(5) (2023) 943-960.

[3] X. Zhao, Z. Fan, C. Zhu, et al., Melanin inspired microcapsules delivering immune metabolites for hepatic fibrosis management, Materials today. Bio 21 (2023) 100711.