熱點(diǎn)實(shí)驗(yàn)服務(wù)：明膠酶譜MMP活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)服務(wù)案例介紹

大鼠心臟組織明膠酶譜MMP活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)儀器  泳電源Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)；電泳儀及附件Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)

實(shí)驗(yàn)標(biāo)本  大鼠心臟組織20個(gè)

實(shí)驗(yàn)試劑

1、凝膠試劑：

30%丙烯酰胺溶液；Tris-Base（SIGMA）；10%SDS（SIGMA）；10%過(guò)硫酸銨；TEMED（sigma）
2、常用溶液及緩沖液：制備含MMP底物蛋白SDS-PAGE凝膠：采用8%分離膠。將20Xsubstrater融化，并90℃加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中加入20Xsubstrate并使之稀釋20倍，混勻，然后再加入過(guò)硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。

A．5%積層膠所用溶液
按總體積2.5ml：
ddH2O：                               1.575ml
30%丙烯酰胺溶液：                      0.42ml
1.0mol/L Tris (PH=6.8)：              0.315ml
10%SDS：                              25ul
20Xsubstrate：                        125ul
10%過(guò)硫酸銨：                          25ul
TEMED：                               3ul
B．8%分離膠溶液
按總體積10ml：
ddH2O：                               4.1ml
30%丙烯酰胺溶液：                      2.7ml
1.0mol/L Tris (PH=8.8)：              2.5ml
10%SDS：                              100ul
20Xsubstrate：                        500ul
10%過(guò)硫酸銨：                          100ul
TEMED：                                6ul
C．電泳緩沖液，1L
3g Tris-Base、14.4g 甘氨酸、1g SDS，加蒸餾水至IL，pH應(yīng)該在8.3左右。也可以制成10×的儲(chǔ)存液，在室溫下長(zhǎng)期保存。

檢測(cè)步驟

A、 陽(yáng)性對(duì)照及待檢測(cè)樣品的前處理及上樣

陽(yáng)性對(duì)照：取5ul positive mixture與2XSDS-PAGE non-reducing buffer 等體積混合。待測(cè)樣品5ul則1：1稀釋于2XSDS-PAGE non-reducing buffer，混合后直接上樣。不加熱變性，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液。每孔點(diǎn)樣10ul。
B、電泳 30mA恒流電泳45min，溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。
C、洗滌凝膠 驅(qū)除凝膠，去除壓縮膠。放入容器中，先用適量蒸餾水沖洗凝膠。然后加入10ml 1Xbuffer A，室溫漂洗凝膠2X15分鐘。中間換液2次。
D、孵育 倒掉Buffer A。加入10ml 1Xbuffer B，室溫孵育4小時(shí)。
E、顯色 倒掉Buffer。加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液水平搖床上染色120min后，再采用脫色液（甲醇濃度為25% ,乙酸濃度為10 %）進(jìn)行脫色60min。

F、條帶掃描 將凝膠放在掃描儀上掃描。用非透射光掃描，顯示調(diào)整為灰度。并分析IOD值。72 kDa為MMP-2，92 kDa為MMP-9。
試劑盒組成與儲(chǔ)存

1. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml µl, −20 ℃
2. MMP-2 and MMP-9 positive mixture 500 µl, −20℃
3. 10 × Substrate G, 50 ml, −20℃
4. 10 × Buffer A, 50 ml, 4℃
5. 10 × Buffer B, 50 ml, 4℃
6. 10 × Mem-Gel Stain, 50 ml, 4℃

詳細(xì)實(shí)驗(yàn)信息請(qǐng)參考以下鏈接：www.jiamay.net/vshow_28_1876.html

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