熱點實驗服務：PKC蛋白激酶活性檢測實驗服務案例介紹

實驗試劑：瓊脂糖（Promega公司，V3125）；其他常備試劑購自sigma公司；PKC活性檢測試劑盒（Promega公司， V5330）
實驗儀器：電泳儀（北京六一廠，112-0640）；水平電泳槽（北京六一廠，122-3146）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（碧云天生物，EBI025）；電熱恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市環(huán)宇科學儀器廠，HH-8）
基本原理：分離PKC蛋白（磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白），利用試劑盒組分將2種蛋白分離并加以區(qū)分，利用電泳瓊脂糖凝膠技術顯示2種不同的蛋白，利用分析軟件將顯示的不同蛋白定量并加以比較，以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值顯示PKC活性（PKC活化度）。

操作步驟：
1．用預冷的勻漿器把細胞勻漿。
2．在4℃，用14,000 × g 離心裂解液5 分鐘，保存上清。
3．用PKC 抽提液預平衡1ml 的DEAE 纖維素柱，再把第2 步中得到的上清過柱。用5ml的PKC 抽提液洗柱子，然后用5ml 含有200mM NaCl 的PKC 抽提液洗脫含有PKC 的組分。
4．用PKC 稀釋液（PKC dilution buffer）將少量蛋白激酶C（Promtein Kinase C）稀釋到2.5ug/ml。隨試劑盒所附的產品信息中標有這個酶的初始濃度。
5．用探頭超聲波破碎儀超聲處理PKC Activator Solution 20-30 秒，或直到溶液變溫暖。
6．對每一個樣品，按照下面所列順序在0.5ml 小離心管中混合PepTag® PKC 5× Buffer,PepTag® C1 Peptide，超聲過的PKC Activator 5X Solution，和水。在樣品加入之前，小離心管一直要放在冰上。陰性對照將用于對反應進行定量時確定其摩爾吸收值（說明書第IV.部分）。

標準PKC檢測
PepTag® PKC Reaction 5X Buffer                        5ul
PepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul)                         5ul
PKC Activator 5X Solution, 超聲處理的                  5ul
短肽保護液（非必須）                                   1ul
樣品                                                  9ul
去離子水使終體積為                                     25ul

PKC陽性對照檢測
PepTag® PKC Reaction 5X Buffer                        5ul
PepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul)                         5ul
PKC Activator 5XSolution, 超聲處理的                   5ul
短肽保護液（非必須）                                    1ul
Protein Kinase C (2.5ug/ml 溶于 PKC dilution buffer）  4ul
去離子水使終體積為                                     25ul

PKC陰性對照檢測（不加PKC）
PepTag® PKC Reaction 5X Buffer                        5ul
PepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul)                         5ul
PKC Activator 5XSolution, 超聲處理的                   5ul
短肽保護液（非必須）                                    1ul
去離子水使終體積為                                     25ul

7．在0 時間點，把一支管子從冰上移到30℃水浴中孵育2 分鐘。然后加入樣品或蛋白激酶C 在30℃ 再孵育30 分鐘。
8．把管子放進開水浴或95℃ 加熱塊10 分鐘以終止反應。在凝膠電泳前把樣品一直避光存放在4℃ 或-20℃。
9．把樣品上樣到膠上之前，往每個樣品中加進1ul 的80％甘油，以確保樣品保留在上樣孔中（說明書第III.F 部分）。
10．每孔點樣10ul，在0.8% 瓊脂糖凝膠上以100V電泳15分鐘分開樣品，拍照。

實驗詳細信息請參考以下鏈接：

www.jiamay.net/vshow_28_1874.html

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