熱點(diǎn)實(shí)驗(yàn)服務(wù)：實(shí)驗(yàn)課題整體外包服務(wù)案例介紹

實(shí)驗(yàn)案例：
          XX蛋白在CD4+/CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞介導(dǎo)的A疾病作用研究
研究方法：
1. 標(biāo)本采集：受試者于清晨空腹平臥位抽取肘靜脈血5ml，注入EDTA抗凝管。
2. CD4+/CD25+ Treg細(xì)胞的分選：應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)CD4+/CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）進(jìn)行流式分選。
3. 熒光定量檢測(cè)Treg中A蛋白及B蛋白mRNA的表達(dá)量。研究目的：探討XX蛋白在A疾病患者與健康人群外周血Treg的差異表達(dá)及其表達(dá)差異在A疾病發(fā)病中的意義。
研究對(duì)象：A疾病初診患者20例為A疾病組（AH），選擇健康體檢者20例為健康對(duì)照組（CN），年齡和性別與A疾病組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

一、人外周血淋巴細(xì)胞分離
實(shí)驗(yàn)試劑：人淋巴細(xì)胞分離液（sigma）;D’hanks液（實(shí)驗(yàn)室常備）
分離方法：取5ml新鮮抗凝血，與D’hanks液1:1混勻后，小心加入5ml的細(xì)胞分離液之液面上，以1500轉(zhuǎn)/分離心（半徑15cm水平轉(zhuǎn)子）15分鐘，此時(shí)離心管中由上至下細(xì)胞分為4層。第一層為血漿或組織勻漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。小心收集第二層細(xì)胞，沉淀經(jīng)反復(fù)洗兩次即可得到淋巴細(xì)胞。用于后續(xù)免疫磁珠分離。隨機(jī)抽取4個(gè)樣本少量細(xì)胞用抗CD4-FITC,CD25-PE標(biāo)記的抗體流式檢測(cè)分離前細(xì)胞CD4+含量。

二、免疫磁珠方法分選CD4+CD25+Treg細(xì)胞及流式鑒定：
原理：免疫磁珠法分離細(xì)胞是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場(chǎng)中，通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，無該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，不在磁場(chǎng)中停留，從而使細(xì)胞得以分離。
實(shí)驗(yàn)材料：人外周血淋巴細(xì)胞；CD4+ CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit human（Miltenyi biotec）;MidiMACS分選器（Miltenyi biotec）;LD和MS分選柱（Miltenyi biotec）;Mouse Anti-human CD4-FITC,11-0048,Excite 488 nm（ebioscience）；Mouse Anti-human CD25-PE,12-0259,Excite 488 nm（ebioscience）；Mouse Anti-human FOXP3-APC,17-4777,Excite 633 nm（ebioscience）

CD4+CD25+Treg分選步驟：略
流式鑒定：取1×105個(gè)細(xì)胞用抗 CD4-FITC、抗CD25-PE的抗體雙色標(biāo)記，室溫避光孵育 30 min后用 PBS液洗滌重懸，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選的 CD4+CD25+T細(xì)胞的純度。另外取1×105個(gè)細(xì)胞用抗 CD4-FITC、抗CD25-PE的抗體雙色標(biāo)記后，用固定劑和通透劑對(duì)其固定打孔后用抗 FOXP3-APC標(biāo)記的抗體進(jìn)行胞內(nèi)因子染色，室溫避光孵育 30 min后用 PBS液洗滌重懸，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選的CD4+CD25+T細(xì)胞胞中FOXP3的表達(dá)情況。
檢測(cè)結(jié)果：圖片顯示各個(gè)區(qū)的檢測(cè)結(jié)果，以CD4熒光強(qiáng)度為橫軸，CD25熒光強(qiáng)度為縱軸，劃分為4個(gè)分區(qū)，各區(qū)意義如下：
左上區(qū)：CD25+細(xì)胞區(qū)
右上區(qū)：CD4+CD25+細(xì)胞區(qū)
左下區(qū)：CD4-CD25-細(xì)胞區(qū)
右下區(qū)：CD4+細(xì)胞區(qū)

詳細(xì)實(shí)驗(yàn)信息請(qǐng)看以下鏈接：

http://www.jiamay.net/vshow_28_1871.html

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